上海崇明地区幽门螺杆菌的耐药性及cagA基因、rdxA基因在幽门螺杆菌耐甲硝唑中的作用

摘要

全世界有50％以上的人感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori),在发展中国家感染率更高,我国在80％左右,是世界卫生组织国际癌症研究机构确定的I类致癌因子。现已证明H.pylori感染与人类多种上消化道疾病密切相关,是引起慢性胃炎以及导致消化性溃疡发生和复发的重要因为,并与低度恶性胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生、发展密切相关。以质子泵抑制剂(PPI)或铋剂为基础加两种抗生素的三联疗法仍是当前国内外抗H.pylori共识意见推荐的一线治疗方法,但近年来,随着抗生素的广泛应用,尤其是不规范应用,导致H.pylori的耐药问题目益突出,已成为根治失败的主要因为。迄今为止,已经证明H.pylori的流行病学及耐药机制各国、各地区都有所不同,因此,有必要进行地区性的H.pylori耐药性监测与耐药机制研究。
　　 目的:
　　 1、分析上海崇明地区H.pylori的感染率及耐药性,以指导临床合理用药；
　　 2、探讨崇明地区含细胞毒素相关基因(cytotoxin associated gene A,cagA)的H.pylori的感染情况及cagA基因与H.pylori的耐药性关系；
　　 3、探讨cagA基因、rdxA基因变异在H.pylori耐甲硝唑中是否起一定的作用。
　　 方法:
　　 1、取消化道疾病患者的胃窦部粘膜组织在体外做H.pylori微需氧培养、鉴定,并收集180株H.pylori菌株;
　　 2、对180株H.pylori采用纸片扩散法(K-B法)对阿莫西林、呋喃唑酮、甲硝唑、替硝唑、克拉霉素、阿奇霉素进行药物敏感性试验。药物试验质控菌株为NCTC11637。对所有的耐阿莫西林的H.pylori菌株使用头孢硝塞吩纸片法检测β-内酰胺酶；
　　 3、对180株临床分离菌株,用E-test法检测H.pylori对甲硝唑的最低抑菌浓度(MIC),以MIC值≥8mg／L判定为甲硝唑耐药。比较K-B法和E-test法的一致性；
　　 4、聚合酶链反应(PCR)扩增cagA基因,分析崇明地区cagA阳性的H.pylori的感染情况及cagA基因与H.pylori的耐药性关系；
　　 5、在进行cagA基因检测及E-test法检测对甲硝唑药物敏感性试验的的180株H.pylori菌株中,随机任选取20株甲硝唑敏感菌及40株耐药菌(含30株高水平耐药株),聚合酶链反应(PCR.)扩增。rdxA基因并对rdxA基因进行测序,与H.pylori26695相应序列进行比对分析；
　　 6、比较cagA基因阳性菌和cagA基因阴性菌对甲硝唑的耐药率；同时对高水平耐药菌中cagA基因阳性菌株和cagA基因阴性菌株的rdxA基因的突变率进行比较分析。
　　 结果:
　　 1、对513例各种消化道疾病患者的粘膜组织进行H.pylori的分离培养,经鉴定,分离出387株H.pylori,崇明地区胃肠道疾病患者H.pylori感染率为75.4％；
　　 2、K-B法检测H.pylori对甲硝唑、替硝唑、阿莫西林、克拉霉素、阿奇霉素、呋喃唑酮的耐药率分别为41.1％、23.3％、5.0％、2.2％、1.7％、2.8％。E-test法检测H.pylori对甲硝唑的耐药率为43.3％。所有的耐阿莫西林的9株H.pylori菌株均未检测到β-内酰胺酶；
　　 3、对180株临床分离的H.pylori菌株进行甲硝唑的E-test试验,各耐药临床菌株MIC变化范围比较大,范围在2-128mg／L,有78株对甲硝唑耐药,甲硝唑的耐药率43.3％,其中高水平耐甲硝唑54株(MIC≥32 mg／L),占69.2％(54／78),比较K-B法和E-test法的一致性,K=0.954,说明两种方法一致性非常好；
　　 4、72.8％的H.pylori菌株含有cagA基因,即高毒力(Ⅰ型)菌株感染率为72.8％。H.pylori菌株中cagA基因阳性菌对甲硝唑的耐药率(29.0％)明显低于cagA基因阴性菌(81.6％),但高水平耐药菌中cagA阳性菌所占比例(76.3％)明显高于cagA阴性菌(55.0％)；
　　 5、与H.pylori26695进行比对分析,rdxA基因突变率为56.7％,rdxA基因变异未发现大片段序列插入或缺失,大多数耐药菌为点突变,表现为只出现单个碱基插入、缺失或置换。甲硝唑耐药菌的rdxA基因突变率(77.5％)明显大于甲硝唑敏感菌(15.0％),同时高耐药菌中cagA阳性菌的rdxA基因的突变率(100％)明显高于cagA阴性菌株(60％)。
　　 结论:
　　 1、H.pylori是胃肠疾病患者发病的重要因素。本地区阿莫西林、阿奇霉素、呋喃唑酮可作为根除H.pylori的首选药物；
　　 2、本地区H.pylori感染以高毒力(Ⅰ型)菌株为主。H.pylori菌株基因分型的检测对临床疾病的诊断与治疗、预后判断及制定根除H.pylori治疗方案等方面有十分重要的意义；
　　 3、rdxA基因变异位点不固定,缺乏明确的突变规律。rdxA基因突变是引起H.pylori对甲硝唑耐药的重要因素;
　　 4、推测在cagA基因阳性的菌株同时存在着rdxA基因突变可能更易引起H.pylori对甲硝唑产生高水平耐药。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

第一章 绪论

1.1 研究背景

1.2 研究目的、内容及技术路线

第二章 幽门螺杆菌感染率与耐药性分析

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂、来源及溶液配制方法

2.1.4 药敏纸片

2.2.方法

2.2.1 标本的收集

2.2.2 H.pylori接种

2.2.3 H.pylori培养

2.2.4 H.pylori鉴定

2.2.5 药敏试验

2.2.6 结果判定

2.2.7 β-内酰胺酶检测

2.2.8 标本的保存

2.2.9 统计学方法

2.3 结果

2.3.1 上消化道疾病中H.pylori的分布

2.3.2 药物敏感试验

2.3.3 多重耐药性情况

2.3.4 β-内酰胺酶检测

2.4 讨论

第三章 幽门螺杆菌cagA基因检测及与耐药的关系

3.1 材料

3.1.1 菌株来源

3.1.2 主要仪器

3.1.3 主要试剂

3.1.4 主要溶液配制方法

3.2 方法

3.2.1 菌种复苏

3.2.2 药敏试验

3.2.3 细菌DNA的制备

3.2.4 PCR检测cagA基因

3.2.5 扩增产物分析

3.2.6 统计学处理

3.3 结果

3.3.1 cagA基因检测

3.3.2 药敏试验结果

3.3.3 H.pylori菌株基因型对甲硝唑的药敏结果比较

3.3.4 两种方法检测H.pylori对甲硝唑的耐药性比较

3.3.5 消化道疾病患者中含cagA基因的H.pylori菌株的分布

3.4 讨论

第四章 cagA基因、rdxA基因变异在幽门螺杆菌耐甲硝唑中的作用

4.1 材料

4.1.1 菌株来源

4.1.2 主要仪器

4.1.3 主要试剂

4.2 方法

4.2.1 PCR检测rdxA基因

4.2.2 PCR产物鉴定

4.2.3 H.pylori DNA的提取

4.2.4 产物测序

4.2.5 统计学处理

4.3 结果

4.3.1 rdxA基因检测

4.3.2 H.pylori菌株rdxA基因DNA序列分析

4.3.3 两种基因型的rdxA基因突变状况

4.3.4 甲硝唑敏感菌与耐药菌中rdxA基因的突变状况

4.4 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

第六章 综述 幽门螺杆菌感染的中西医治疗研究进展

6.1 西医对H.pylori感染治疗研究进展

6.1.1 传统的抗H.pylori治疗方法

6.1.2 疫苗治疗方法

6.1.3 基因水平的治疗

6.1.4 宿主遗传基因多态性检测

6.2 中医药对H.pylori感染治疗研究进展

6.2.1 单味中药对H.pylori的抑菌作用

6.2.2 复方中药治疗H.pylori感染

6.3 中西医结合治疗H.pylori感染

6.4 问题与展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文及科研课题