儿童感染幽门螺杆菌甲硝唑耐药状况及rdxA、frxA基因在耐药机制中作用的研究

摘要

幽门螺杆菌(HelicobacterPylori，H.pylori)是全球最常见的病原体之一，是成人慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，并与某些胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织(Mucosa-AssociatedLymphoidTissue，MALT)淋巴瘤密切相关，根除H.pylori能有效的控制了消化性溃疡的发生和再发，并可使部分MALT淋巴瘤自行消退。儿童一旦感染H.pylori难以自行清除，不仅仅导致慢性胃炎和消化性溃疡，还可以导致铁缺乏甚至缺铁性贫血和生长发育迟缓等；有学者认为根除儿童感染H.pylori有助于阻断或延缓胃粘膜萎缩和肠化的发展从而控制胃腺癌、胃MALT淋巴瘤的发病率。甲硝唑(Metronidazole，MTZ)以其用药后胃部浓度高、对胃酸稳定且抑菌浓度与杀菌浓度接近的优点，是目前推荐的根除方案中重要组成药物之一。随着MTZ在人群中的应用，H.pylori对MTZ的原发和继发耐药株(MTZR)的出现导致了耐药率逐年迅速上升、含MTZ的方案根除率下降甚至根除失败。对儿童感染H.pylori的MTZ耐药状况变化特点及耐药机制的探讨迫切而重要，但国内缺乏相应的研究；此中适用于MTZ的MIC判断方法有争议，本研究将一并进行探讨。 44株(2002年10月～2004年1月间)与83株(2004年12月～2005年7月间)的H.pylori临床菌株，分别来自此期间因上消化道症状在浙江大学医学院附属儿童医院行胃镜检查的患儿胃窦部粘膜。胃窦粘膜标本匀浆后接种于含有选择性抗生素的培养基，37℃微需氧环境(5％O2，15％CO2和80％N2)培养3天，选用形态单一的针尖大小透明菌落同步进行尿素酶、过氧化氢酶(触酶)和氧化酶鉴定阳性，并经Gram染色为阴性弯曲杆菌(海鸥状或“S”型)者定为H.pylori菌株。以琼脂稀释法为准测定所有H.pylori菌株的MIC值，以MIC＞8.0mg/L为耐药，同时以E-test方法测定其中55株MIC值。随机选出11株野生MTZS菌株及其对应的获得性MTZR株RAPD-PCR基因指纹检测，并对其中9株野生MTZS菌株及其对应的获得性MTZR株和5株随机选择的野生MTZR株(MIC≥256mg/L)的rdxA、frxA基因测序分析，采用DNAMAN5.2.2软件、以H.pylori标准株26696序列中rdxA基因(HP0954)和frxA基因(HP0642)定位碱基序列。 结果显示：(1)2002～2004年组和2004～2005年组H.pylori的MTZ耐药率分别为31.82％和51.81％(P=0.031)，MIC值范围分别是＜0.125～128mg/L和0.25～＞256mg/L，MIC50、MIC90值分别为0.5mg/L、128mg/L和16mg/L、128mg/L；上述结果显示耐药率和MIC50呈现升高趋势。(2)相对于琼脂稀释法，E-test法对H.pylori的MTZ药敏的判断敏感性73.08％、特异性100％，二者符合率87.27％，相关性良好(x2=32.38，P＜0.001)，但在两方法对照的所有55株对应MIC值中，28株有22～26个数量级以上差别，提示E-test法用于MTZ敏感性判断时可能需要加做琼脂稀释法以防MTZR株漏诊。(3)11株野生MTZS株与对应的诱导MTZR株中，8株RAPD-PCR指纹一致，3株有一条以上主要条带差别；但无论指纹图一致与否，其rdxA基因和frxA基因均能扩增出大小相当的DNA片段，且诱导耐药前后序列间高度同源(分别为rdxA基因序列99.45％±0.30％同源，frxA基因序列99.24％±0.33％同源)。表明在体外MTZ诱导下，野生MTZS株变成获得性MTZR株可能源于其基因组序列发生了起始突变，但RAPD-PCR指纹变化不能鉴别耐药与否，有必要进一步对rdxA基因和frxA基因进行测序分析。 对所有菌株的基因分析发现：野生MTZS菌株rdxA基因和frxA基因与标准株同源性分别为94.47％～95.89％(95.00％±0.16％)和94.04％～95.54％(94.71％±0.16％)，序列中碱基插入或缺失所致Gap分别为0处和0～7(1.44±0.78)处；对应的获得性MTZR株rdxA基因序列和frxA基因序列与野生MTZS株同源性分别为97.63％～100％(99.45％±0.30％)和97.14％～100％(99.24％±0.33％)，新发Gap分别为0~1(0.33±0.17)处和0～6(1.78±0.66)处；rdxA基因和frxA基因分别1株和2株MTZS株诱导耐药前后无新发突变。获得性MTZR株rdxA基因新发点突变(PointMutation)共计34处，其中碱基插入1处、缺失2处，点突变引起的碱基替代31处，替代以转换(嘌呤换嘌呤或嘧啶换嘧啶)为主(Y占15/31，R占11/31)；未见新发多点突变(MultipleMutation)。获得性MTZR株frxA基因共计新发点突变52处，其中碱基插入15处、缺失3处，点突变引起的碱基替代34处，替代以转换为主(Y占17/34，R占11/34)；新发多点突变2处。随机选出的5株野生MTZR株中，rdxA基因和frxA基因与H.pylori标准株26695序列同源性分别为94.44％～95.42％(95.06％±0.20％)和93.88％～98.77％(95.29％±0.89％)，序列中原有Gap分别为0～3(1.6±0.6)处和0～1(0.40±0.24)处。5株野生MTZR株rdxA基因共计原有点突变139处，其中碱基插入2处，点突变引起的碱基替代137处，替代以转换为主(R占64/137，Y占53/137)；原有多点突变12处，其中碱基缺失2处、碱基替代10处。5株野生MTZR株frxA基因共计原有点突变155处，其中碱基缺失2处，点突变引起的碱基替代153处，替代以转换为主(R占65/153，Y占58/153)；未见原有多点突变。获得性MTZR株rdxA基因31处新发点突变碱基替代中，12处与野生MTZR株原有替代位点与类型一致，1处碱基替代位点相同但类型不同，1处单碱基插入对应野生MTZR株替代位点，其余碱基替代或碱基插入、缺失位点与数目间各不相同。获得性MTZR株frxA基因34处新发点突变碱基替代中，16处与野生MTZR株原有替代位点与类型一致，1处碱基缺失位点及类型一致，1处碱基替代位点对应，另有6处新发单碱基插入和缺失位点与野生MTZR株原有碱基替代位点相对应，其余碱基替代及插入、缺失位点并不对应；获得性MTZR株frxA基因1处新发多点突变对应野生MTZR株DNA序列中原有单碱基替代位点。上述结果表明，rdxA基因和frxA基因突变常常是多位点、多类型随意发生，其突变位点和类型与H.pylori的MTZ耐药程度的相关性还需进一步大量深入研究；有意义的是，rdxA基因和frxA基因分别1株和2株MTZS株诱导耐药前后无新发突变，提示可能存在该二基因突变之外的MTZ耐药机制。 综上，本研究得出结论：1.本地区儿童感染H.pylori对MTZ的耐药率呈升高趋势；2.E-test法判断H.pylori对MTZ敏感性时，建议加做琼脂稀释法以防MTZR株漏诊；3.rdxA基因和frxA基因突变常为多位点、多类型随意发生；4.H.pylori的MTZ耐药可能具有rdxA基因和frxA基因突变以外的其它机制。

目录

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

儿童体内幽门螺杆菌对甲硝唑耐药机制研究进展

致谢