TNFα-Tumstatin融合基因修饰间质干细胞及核糖体蛋白S25调节p53抗肿瘤作用

摘要

目的：
　　 探讨慢病毒载体介导TNFα-Tumstatin融合基因修饰间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体内外抗前列腺癌作用及机制，为MSCs在前列腺癌基因治疗中的应用提供理论基础和实验依据；研究核糖体蛋白S25(ribosomal protein S25，RPS25)对p53蛋白的调节作用、机制及生物学意义，揭示S25的新功能及在抗肿瘤研究中的作用。
　　 方法：
　　 (1)分离培养不同来源的MSCs，流式细胞术检测其表面标志。三质粒系统介导慢病毒包装、生产并转染MSCs，流式细胞术检测慢病毒对不同来源MSCs的转染效率。构建慢病毒-信号肽-TNFα-Tumstatin表达载体并转染MSCs，应用PCR、Western blot、免疫组化和ELISA检测目的基因和蛋白的表达。
　　 (2)慢病毒介导信号肽-TNFα-Tumstatin融合基因转染MSCs，检测其分泌上清对前列腺癌细胞PC3和LNCaP生长、增殖和凋亡的作用；检测分泌上清对内皮细胞体外网状形成能力影响。应用体内裸鼠移植瘤模型检测MSCs介导的TNFα-Tumstatin对前列腺癌生长抑制作用；应用免疫组织化学染色和TUNEL染色检测体内TNFα-Tumstatin对肿瘤细胞增殖、凋亡和肿瘤血管生成影响；Westernblot检测TNFα-Tumstatin对肿瘤细胞内信号转导通路的调节。
　　 (3)酵母双杂交筛选MDM2蛋白的相互作用分子。应用分子克隆技术构建核糖体蛋白S25原核及真核表达载体，采用免疫共沉淀、GST pull-down和免疫印迹鉴定MDM2蛋白与S25蛋白体内外相互作用。免疫荧光染色检测S25蛋白细胞内定位情况。
　　 (4)检测S25过表达对p53蛋白表达的变化。应用荧光虫素酶报告基因分析、细胞周期分析、细胞凋亡和细胞增殖实验研究S25对p53蛋白功能的作用。检测S25基因敲除对核糖体应激诱导p53蛋白表达和活化的影响。免疫共沉淀和Western blot检测S25对p53蛋白降解、半衰期及泛素化修饰的作用。
　　 结果：
　　 (1)分离获得多种来源的MSCs，培养的MSCs表达CD13、CD29、CD44和CD105，不表达CD31、CD34、CD45及HLA-DR。包装获得高活性的慢病毒，对多种MSCs实现高效转染，转染效率达80％以上。转染后可在MSCs中检测出TNFα-Tumstatin重组基因和蛋白表达。
　　 (2)体外TNFα-Tumstatin可抑制雄激素依赖型和非依赖型前列腺肿瘤细胞增殖、生长及诱导其凋亡；同时TNFα-Tumstatin还能够抑制内皮细胞在基质胶上的网状结构形成。体内MSCs介导的TNFα-Tumstatin通过抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡和降低血供来抑制裸鼠前列腺癌模型生长。TNFα-Tumstatin体内外抗肿瘤机制与抑制前列腺肿瘤细胞内ERK-1/2和Akt蛋白磷酸化，增加Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达，活化caspase-3和8有关。
　　 (3)S25蛋白体内外可与MDM2蛋白直接相互结合。S25蛋白的42～93位氨基酸是MDM2蛋白的结合区域。S25通过MDM2与p53蛋白形成蛋白复合体。S25蛋白主要定位于细胞核仁，其核仁定位信号位于1～41位氨基酸内。核糖体应激可以促进S25蛋白与MDM2蛋白相互结合。
　　 (4)S25通过调节MDM2的E3泛素连接酶活性，抑制MDM2介导的p53泛素化和蛋白降解。S25延长p53蛋白半衰期，稳定p53蛋白，促进p53蛋白转录活性，诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡，抑制增殖。S25蛋白核仁定位区和MDM2结合区共同作用调控p53蛋白。S25基因敲除抑制核糖体应激诱导的p53活化。MDMX参与S25对MDM2 E3泛素连接酶活性的调节。
　　 结论：
　　 MSCs介导转运TNFα-Tumstatin重组基因体内外可抑制前列腺癌生长，其机制与抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和抗血管生成作用相关。TNFα-Tumstatin-MSCs为前列腺癌基因治疗提供了新的策略，具有潜在临床应用价值；核糖体蛋白S25通过与MDM2相互作用，调控p53蛋白表达和活性，是新的p53调节分子。S25-MDM2-p53信号通路的发现为核糖体蛋白的“核糖体外”功能提供了新证据，并为开发MDM2-p53信号通路的新调节剂提供了理论基础和实验依据。