CyPA与ROS在OX40-OX40L受体配体轴介导的动脉粥样硬化中的作用及机制研究

摘要

目的：
　　 本研究观察颈动脉粥样硬化斑块模型小鼠体内血脂水平，OX40、亲环素A(CyPA)的表达及CD4+OX40+淋巴细胞内活性氧(ROS)水平的变化，并探讨OX40/OX40L相互作用对淋巴细胞CyPA分泌及ROS水平的影响。
　　 方法：
　　 本研究分体内体外两部分。体内实验以C57BL/6J小鼠为实验对象，采用高脂饮食及颈动脉硅胶圈植入法快速制作颈动脉粥样斑块模型;体外实验分离培养小鼠脾脏淋巴细胞进行研究。苏木精-伊红（HE）染色分析颈动脉斑块形成情况与病理形态学变化。免疫组化检测颈动脉粥样斑块中CyPA表达，WesternBlot检测体内外脾脏淋巴细胞内CyPA的表达及分泌水平，流式细胞术分别检测体内外脾脏淋巴细胞中OX40、CD4+OX40的表达及OX40+、CD4+OX40+细胞内的ROS水平。
　　 结果：
　　 (1)与正常对照组相比，实验组小鼠血清TC、LDL明显升高，HDL则明显降低，TG变化无统计学意义。
　　 (2)正常对照组颈动脉管壁呈半透明状，无脂纹和斑块形成，内膜光滑平整，弹力板完整。模型小鼠患侧颈动脉有明显斑块形成，含大量泡沫细胞，富含脂质，可见胆固醇结晶，弹力板变性、断裂。
　　 (3)无论正常C57BL/6J小鼠，还是颈动脉粥样硬化模型小鼠，OX40+、CD4+OX40+淋巴细胞内ROS水平明显高于OX40-、CD4+OX40-细胞。
　　 (4)与对照小鼠相比，模型小鼠脾脏中OX40+细胞数明显增加，P＜0.05;CD4+OX40+细胞数增加，但差异无统计学意义。
　　 (5)与正常对照组比较，实验组C57BL/6J小鼠颈动脉粥样硬化斑块及脾脏淋巴细胞中可见大量CyPA表达。
　　 (6)体外培养的脾脏淋巴细胞中anti-OX40刺激OX40-OX40L轴后，淋巴细胞OX40表达和ROS水平明显上调，且随时间的增加而增加，36h达最大差异。Anti-OX40L特异性抑制OX40-OX40L轴能明显降低淋巴细胞OX40表达和ROS水平，36h达最大差异。
　　 (7)体外培养的脾脏淋巴细胞中anti-OX40刺激OX40-OX40L轴后6h，即可在培养液内检测到CyPA，利用Anti-OX40L特异性抑制OX40-OX40L轴后可明显抑制CyPA分泌。
　　 结论：
　　 (1)植入颈动脉硅胶圈及喂养高脂饲料可以快速诱导C57BL/6J小鼠产生颈动脉粥样硬化斑块。
　　 (2)OX40的表达有助于提升细胞内ROS水平，OX40/OX40L相互作用能调控淋巴细胞分泌CyPA。CyPA和ROS很可能是受OX40-OX40L轴调控的影响动脉粥样斑块进展的下游分子。

目录

声明

摘要

前言

1．共刺激分子OX40／OX40L与动脉粥样硬化

1．1 共刺激分子OX40／OX40L生物学功能

1．2 共刺激分子OX40／OX40L在动脉粥样硬化中的作用

2．亲环素A、活性氧与动脉粥样硬化

2．1 CyPA的生物学特性

2．2 ROS的生物学特性

2．3 ROS与CyPA在动脉粥样硬化中的相互作用及关系

3．展望

第一部分 正常小鼠体内OX40表达及OX40+淋巴细胞内活性氧的水平

1 材料

1．1 仪器

1．2 试剂及材料

1．3 手术器械

1．4 实验动物

2 方法

2．1 脾脏细胞收集

2．2 流式细胞术检测

2．3 免疫荧光染色

3 统计学处理

4 结果

4．1 正常小鼠脾脏内OX40的表达

4．2 OX40+、CD4+OX40+细胞内ROS的水平

5 讨论

第二部分 制作C57BL／6J小鼠动脉粥样硬化模型并检测相关指标

1 材料

1．1 仪器

1．2 试剂及材料

1．3 手术器械

1．4 实验动物

1．5 高脂高胆固醇饲料

2 方法

2．1 实验动物分组

2．2 C57BL／6J小鼠动脉粥样硬化模型的制备

2．3 病理取材及病理组织学观察

2．4 血脂指标分析

2．5 Western-Blot分析CyPA蛋白表达量

2．6 流式细胞术检测

3 结果

3．1 血脂变化情况比较

3．2 颈动脉斑块HE染色结果

3．3 脾脏中淋巴细胞上OX40蛋白表达

3．4 颈动脉斑块及脾脏中CyPA蛋白表达量的变化

3．5 脾脏中OX40+细胞内ROS水平的变化

4 讨论

第三部分 体外干预OX40-OX40L轴对淋巴细胞内活性氧水平及亲环素A分泌的影响

1 材料

1．1 仪器

1．2 试剂及材料

1．3 主要溶液及成份

1．4 实验动物

2 方法

2．1 收集C57BL／6J小鼠脾脏淋巴细胞

2．2 分组并培养

2．3 Western Blot检测细胞内外CyPA的蛋白量

2．4 流式细胞术检测OX40+细胞内ROS水平的变化

3 结果

3．1 体外刺激阻断OX40-OX40L轴对淋巴细胞的影响

3．2 体外刺激阻断OX40-OX40L轴对CD4+细胞内OX40表达的影响

3．3 体外刺激阻断OX40-OX40L轴对CD4+OX40+细胞内ROS水平的影响

3．4 体外刺激阻断OX40-OX40L轴对淋巴细胞CyPA蛋白分泌的影响

4 讨论

第四部分 结论

综述

参考文献

常用缩略词对照表

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢