耐酒精醋酸菌的定向筛选及其乙醇脱氢酶(AdhA)的枯草芽孢杆菌芽孢表面展示

摘要

芽孢杆菌属(Bacillus spp.)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因其具有独特的增香功能，被认为是白酒酿造工业中重要的功能微生物之一。然而酒精发酵过程中高浓度的乙醇客观上不可避免地对芽孢菌属细菌细胞的生长和增殖造成了胁迫从而影响或抑制其增香能力。因此，通过基因工程的方法来获得具有高度酒精耐受性的改良菌株对于提高白酒的香味品质而言具有重要的经济价值和现实意义。
　　 醋酸菌（Acetic acid bacteria，AAB）如醋杆菌属(A cetobacter spp.)和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter spp.）均为食醋发酵行业中广泛采用的优势菌种，因其具有高活性的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)而表现出高度的耐酒精及耐酸性能。许多研究也证实了巴斯德醋杆菌(A cetobacter pasteurianus)中编码乙醇脱氢酶亚基(I)的adhA基因对于其发挥氧化乙醇等催化功能是必需的。
　　 枯草芽孢杆菌在营养缺乏或其他胁迫的条件下能够形成芽孢，因其具有独特的抗逆性能够在极端环境（如高温、辐射和毒性化学物质）中长期存活。此外，芽孢衣壳蛋白（如CotB、CotC、CotG和CotE等）已被证实可用作运载外源蛋白、酶类或生物活性分子的有效载体。这些独特的性质使得芽孢表面展示系统成为一种极具发展前景的技术手段，可用于定向改良传统的枯草芽孢杆菌等芽孢菌属微生物。
　　 因此，本研究首先通过定向筛选的方法从工业发酵醋醪中获得一株酒精耐受性醋酸菌，再分离并克隆其乙醇脱氢酶基因（adhA），进一步利用外源蛋白表达系统和芽孢表面展示技术，将优势醋酸菌的乙醇脱氢酶(AdhA)展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面，最终达到定向改良重组菌株酒精耐受性能的目的，主要的研究内容及结果如下:
　　 1、工业发酵醋醪中耐酒精醋酸菌的定向筛选及其分子鉴定
　　 通过模拟工业醋酸发酵的初始环境并结合醋酸菌自身的生长特性，对发酵醋醪中的耐酒精醋酸菌进行定向筛选和分子鉴定。初筛使用GYEC固体分离培养基（设置不同浓度梯度的乙醇作为选择压）对混合菌群中的耐酒精产酸菌进行分离，复筛则通过PCR扩增醋酸菌属adhA基因保守区来初步鉴定醋酸菌同时排除其他产酸菌，同时对PCR结果呈阳性的菌株进行16S rDNA基因的分子鉴定，最终成功地获得了一株能够耐受较高乙醇浓度(7％，v/v)的醋酸菌ET-7-3。
　　 2、醋酸菌乙醇脱氢酶adhA基因的原核表达及多克隆抗体的制备
　　 根据NCBI GenBank数据库提供的核酸序列设计特异性引物，PCR扩增获得目的基因adhA，经T-A克隆并测序验证后构建原核表达载体pET30a(+)-adhA，利用大肠杆菌表达系统诱导目的蛋白His6-Adh大量表达，经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定后免疫新西兰大白兔，收集抗血清用于多克隆抗体的制备。
　　 3、枯草芽孢杆菌芽孢表面展示Adh及其酒精耐受性分析
　　 以醋酸菌乙醇脱氢酶基因adhA作为外源基因，以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC为载体，构建融合表达CotC-AdhA的整合型重组质粒pJS700-adhA，转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，分别经淀粉板筛选和交叉引物的PCR验证后获得阳性重组子。采用耗竭培养法诱导芽孢形成，提取芽孢蛋白用于Western blotting鉴定及免疫荧光分析，结果证明融合蛋白CotC-AdhA获得成功表达并被展示在重组菌株的芽孢表面。设计酒精耐受性实验，通过统计供试菌株在不同浓度乙醇胁迫下的存活率，对其酒精耐受性能做出初步的分析和评价。结果表明:芽孢表面展示了外源AdhA蛋白的重组枯草芽孢杆菌相对于野生型出发菌株而言，对于高浓度的乙醇胁迫环境表现出较为明显的耐受性优势，暗示其具有潜在的工业应用价值。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 文献综述

1．1．1 食醋的工业发酵与优势醋酸菌的定向选育

1．1．2 乙醇脱氢酶

1．1．3 枯草芽孢杆菌及芽孢表面展示系统

1．2 本研究的目的和意义

1．3 主要研究内容和技术路线

1．3．1 主要研究内容

1．3．2 技术路线

第二章 耐酒精醋酸菌的定向筛选及分子鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 样品来源

2．1．2 菌株

2．1．3 培养基

2．1．4 主要试剂

2．1．5 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 发酵醋醪中醋酸菌的富集培养

2．2．2 使用乙醇作为选择压对耐酒精产酸菌进行初筛

2．2．3 adhA基因的PCR扩增用于醋酸菌的定向复筛

2．2．4 目的菌株的分子鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 发酵醋醪中耐酒精产酸菌的初筛

2．3．2 耐酒精醋酸菌的复筛

2．3．3 菌株ET-7-3的分子鉴定

2．4 本章小结

第三章 醋酸菌adhA基因的原核表达及多克隆抗体的制备

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 试剂的配制

3．1．4 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 序列来源

3．2．2 目的基因的克隆与鉴定

3．2．3 原核表达载体的构建

3．2．4 AdhA在E．coli BL21(DE3)中的表达及SDS-PAGE分析

3．2．5 Western blotting鉴定

3．2．6 多克隆抗体的制备

3．3 结果与分析

3．3．1 醋酸菌adhA基因的克隆与鉴定

3．3．2 原核表达载体pET30a(+)-adhA的构建

3．3．3 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析

3．3．4 Western blotting鉴定

3．3．5 AdhA多克隆抗体的制备

3．4 本章小结

第四章 枯草芽孢杆菌芽孢表面展示AdhA及酒精耐受性分析

4．1 实验材料

4．1．1 菌种和质粒

4．1．2 主要试剂

4．1．3 试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 adhA基因的克隆及鉴定

4．2．2 整合型重组质粒pJS700-adhA的构建

4．2．3 融合表达重组芽孢的枯草芽孢杆菌菌株的筛选与鉴定

4．2．4 表面展示CotC-AdhA重组芽孢的诱导及鉴定

4．2．5 重组菌株的酒精耐受性分析

4．3 结果与分析

4．3．1 醋酸菌adhA基因的克隆与鉴定

4．3．2 整合型重组质粒pJS700-adhA的构建与鉴定

4．3．3 融合表达重组芽孢的枯草芽孢杆菌菌株的筛选与鉴定

4．3．4 融合蛋白CotC-AdhA的表达和鉴定

4．3．5 重组枯草芽孢杆菌的酒精耐受性分析

4．4 本章小结

第五章 总结和展望

5．1 主要工作总结

5．1．1 耐酒精醋酸菌的定向筛选及分子鉴定

5．1．2 醋酸菌adhA基因的分子克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

5．1．3 芽孢表面展示CotC-AdhA融合蛋白及重组菌株的酒精耐受性分析

5．2 展望

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文及参加课题