小儿包皮来源间质干样细胞对胃癌SGC-7901细胞生长抑制作用及机制

摘要

目的：分离培养小儿包皮间质干样细胞(humanmesenchymalstemcell-likecellsfromforeskin，hFMSCs)，观察其对SGC-7901胃癌细胞株的生长作用及机制;探究hFMSCs对肿瘤细胞miR-106b、miR-486和miR-.451表达的影响;结合临床胃癌患者miR-106b、miR-486和miR-451的表达情况判断hFMSCs的治疗潜能。
　　 方法：采用组织块贴壁培养方法分离hFMSCs，体外观察hFMSCs形态，应用流式细胞术检测MSCs表面标记，成骨和成脂诱导分化评价hFMSCs的多向分化潜能。将hFMSCs与SGC-7901肿瘤细胞进行BALB/c裸鼠皮下共注射致瘤，通过免疫组化和TUNEL技术检测体内SGC-7901单独注射组与hFMSCs和SGC-7901共同注射组肿瘤细胞的PCNA的表达和肿瘤细胞凋亡情况;然后进一步在体外通过MTT和Westernblotting技术检测hFMSCs对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响;实时荧光定量PCR技术检测hFMSCs对人胃癌细胞株SGC-7901和HGC27miR-106b、miR-486和miR-451表达的影响;对人胃炎、胃癌标本中miR-106b、miR-486和miR-451的表达进行实时荧光定量PCR检测，应用SPSS17.0软件分析它们在胃炎和胃癌中的表达情况及与临床胃癌诊断的关系。
　　 结果：成功分离并鉴定hFMSCs，发现hFMSCs裸鼠皮下与SGC-7901肿瘤细胞共同移植后，肿瘤细胞增殖能力减弱、凋亡增加，肿瘤生长减慢;体外结果表明hFMSCs可以抑制肿瘤细胞增殖;无论是体内或体外，hFMSCs作用后肿瘤细胞凋亡相关蛋白BAX和Caspase-3表达均增加，BCL2表达减少。hFMSCs上清预处理SGC-7901及HGC27胃癌细胞株后miR-106b、miR-486和miR-451表达水平观察，发现SGC-7901在hFMSCs作用后miR-106表达明显下调（P＜0.01），miR-486表达上调（P＜0.05），miR-451与对照组相比没有统计学意义上的变化。而hFMSCs作用后的HGC27miR-106b、miR-486和miR-451表达均下调，且有统计学意义。对于临床胃癌组织标本，miR-106b、miR-486和miR-451表达明显高于胃炎标本(P＜0.01)。临床胃癌患者临床资料分析显示miR-106b用于诊断胃癌病人的灵敏度为45.5％，特异度为96.6％，曲线下面积为0.707，截断值为0.2040;miR-486用于诊断胃癌病人的灵敏度为81％，特异度为86％，曲线下面积为0.826，截断值为0.0228;应用miR-451监测诊断胃癌病人的灵敏度为73.7％，特异度为67.9％，曲线下面积为0.698，截断值为0.1498。
　　 结论：成功建立从小儿包皮分离和培养hFMSCs方法，小儿包皮可作为间质干样细胞的来源。hFMSCs体内外均具有抑制肿瘤细胞增殖能力和促进肿瘤细胞凋亡的能力。HFMSCs可改变胃癌细胞miR-106b、miR-486和miR-451表达，而miR-106b、miR-486和miR-451在临床胃癌组织高表达，且可作为胃癌诊断的生物学标志物。这提示hFMSCs具有一定的胃癌治疗潜能。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 MSCs与肿瘤生长

1．1．1 MSCs的来源和特性

1．1．2 MSCs和肿瘤生长

1．2 MSCs与肿瘤转移

1．2．1 MSCs、肿瘤淋巴管生成与肿瘤转移

1．2．2 MSCs、上皮间质转化与肿瘤转移

1．2．3 MSCs、肿瘤干细胞与肿瘤转移

1．3 MSCs、microRNAs与肿瘤

1．3．1 microRNAs的生成和功能

1．3．2 MSCs的microRNAs表达变化影响肿瘤发展

1．3．3 microRNAs的临床应用潜能

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究方法

2．3 实验设计方案

2．4 研究意义

第三章 小儿包皮来源间质干样细胞的分离培养及鉴定

3．1 材料和试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器、耗材

3．2 方法

3．2．1 HFMSCs的分离培养和形态分析

3．2．2 流式细胞仪检测hFMSCs的干细胞表面标记

3．2．3 RT-PCR检测hFMSCs干性基因的表达

3．2．4 平板克隆检测hFMSCs的克隆增殖能力

3．2．5 HFMSCs的生长曲线绘制

3．2．6 HFMSCs的遗传特性和细胞周期特点

3．2．7 成骨和成脂诱导培养

3．3 结果

3．3．1 HFMSCs的分离培养及形态特征

3．3．2 HFMSCs表达间质干细胞相关表面标志

3．3．3 HFMSCs表达干细胞相关基因

3．3．4 HFMSCs具有强的克隆增殖能力

3．3．5 HFMSCs的生长曲线

3．3．6 HFMSCs的核型和细胞周期分布特点

3．3．7 HFMSCs诱导分化为骨细胞和脂肪细胞

3．4 讨论

第四章 HFMSCs体内和体外对肿瘤细胞的生长作用

4．1 材料与仪器

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要仪器、耗材

4．2 方法

4．2．1 HFMSCs裸鼠皮下对SGC-7901生长的观察

4．2．2 HE染色、免疫组化检测hFMSCs体内对肿瘤细胞增殖的影响

4．2．3 TUNEL分析hFMSCs体内对肿瘤细胞凋亡的影响

4．2．4 MTT和细胞计数检测hFMSCs体外对肿瘤细胞增殖的影响

4．2．5 Western blotting检测hFMSCs作用后肿瘤细胞凋亡相关蛋白的变化

4．3 结果

4．3．1 体内hFMSCs作用后肿瘤细胞生长受抑制

4．3．2 体内hFMSCs作用后肿瘤细胞增殖活力减弱

4．3．3 体内hFMSCs作用后肿瘤细胞凋亡增加

4．3．4 体外hFMSCs抑制肿瘤细胞生长

4．3．5 HFMSCs促进肿瘤细胞促凋亡蛋白的表达

4．4 讨论

第五章 HFMSCs影响胃癌细胞miR-106b／486／451的表达及miR-106b、miR-486、miR-451的胃癌组织诊断潜能

5．1 材料与仪器

5．1．1 主要材料

5．1．2 主要仪器、耗材

5．2 方法

5．2．1 qRT-PCR检测hFMSCs对胃癌细胞株miR-106b／486／451表达的影响

5．2．2 石蜡组织包埋胃炎及胃癌标本microRNA的提取

5．2．3 qRT-PCR胃炎和胃癌miR-106b／486／451表达的差异检测

5．2．4 数据处理与统计

5．3 结果

5．3．1 HFMSCs影响胃癌细胞miR-106b／486／451的表达

5．3．2胃癌miR-106b／486／451的表达高于胃炎标本

5．3．3 miR-106b／486／451对临床胃癌的诊断潜能

5．4 讨论

结论与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间获奖及发表的学术论文