Tet-On诱导表达系统的构建及TROP2生物学功能的研究

摘要

研究目的:
　　通过在293细胞中建立Tet-On诱导基因表达系统，检测该系统是否能诱导TROP2蛋白的表达，并探讨TROP2蛋白在促进细胞增殖、迁移与侵袭功能方面的作用。
　　研究方法:
　　1.Tet-On-Advanced稳定细胞株的构建
　　用Tet-On-Advanced质粒转染293细胞，通过G418筛选，RT-PCR法检测四环素反应转录活化因子(rtTA)基因，筛选转染阳性克隆。通过pTRE-Tight-Luc载体转染上述阳性转染克隆，经强力霉素(DOX)诱导荧光素酶表达，用萤火虫荧光素酶试剂盒检测，验证Tet-On系统，筛出稳定细胞株。
　　2.DOX调节293细胞中TROP2蛋白的表达
　　构建含TROP2基因的重组载体pTRE-Tight-TROP2:采用PCR扩增TROP2基因，提取pTRE-Tight质粒，EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切TROP2基因与pTRE-Tight质粒，T4连接酶连接酶切产物，转化感受态DH5α，挑单克隆菌株摇菌，将菌液做模板，扩增TROP2基因，取阳性株提取重组质粒，送公司测序。
　　将pTRE-Tight-TROP2转染进Tet-On-Advanced稳定转染株，设立不同实验组:Ⅰ组:不转染pTRE-Tight-TROP2质粒组;Ⅱ组:转染pTRE-Tight-TROP2质粒且加DOX(1000ng/ml)组;Ⅲ组:转染pTRE-Tight-TROP2质粒且不加DOX组。RT-PCR检测不同组细胞的TROP2基因，FCM检测不同组细胞的TROP2蛋白表达。
　　3.TROP2蛋白对细胞增殖、迁移与侵袭功能的作用
　　通过增殖实验、划痕实验、Transwell迁移实验与Transwell侵袭实验检测TROP2蛋白功能。
　　研究结果:
　　1.Tet-On-Advanced稳定细胞株的构建
　　Tet-On-Advanced质粒转染293细胞，经过G418筛选和亚克隆，获得21株单克隆细胞株，扩大培养。RT-PCR检测21株单克隆细胞株中四环素反应转录活化因子(rtTA)基因，结果显示，21株单克隆株中，有10株检测到rtTA基因，编号为1-10。从10株细胞株中，用萤火虫荧光素酶检测试剂盒挑选稳定转染细胞株，结果显示，加DOX组的荧光素酶活性检测结果明显高于不加DOX组，从中选出荧光度值高于3000的4株细胞（1、2、6、9、号细胞株）为候选细胞。考虑到本底的因素，1号细胞株被选出做为转染效果最好的细胞株，用于后续试验。
　　2.DOX调节293细胞中TROP2蛋白的表达
　　PCR法扩增TROP2基因，结果显示有大小为969bp的条带，与预期结果相符。TROP2基因与pTRE-Tight载体经双酶切、连接、转化DH5α感受态细菌、涂板，挑10个单克隆菌落进行摇菌，将菌液做模板，扩增TROP2基因，得2株阳性菌株。提取质粒，电泳显示大小均为3574bp，与预期结果一致。核酸序列分析结果证明其序列正确，表明所得质粒为重组质粒pTRE-Tight-TROP2。
　　pTRE-Tight-TROP2重组质粒转染Tet-On-Advanced稳定细胞株，经DOX诱导，RT-PCR法检测3组细胞中TROP2基因的表达水平，FCM法检测3组细胞中TROP2蛋白的表达水平。结果显示，加DOX组细胞中TROP2基因、蛋白的水平明显高于对照组。
　　3.TROP2蛋白对细胞增殖、迁移与侵袭功能的作用
　　MTT法检测细胞生长、增殖情况，结果显示，加DOX组细胞增殖速度明显比对照组细胞快;划痕实验与Transwell迁移实验用于检测细胞迁移功能，拍照记录、MTT检测与结晶紫染色结果显示，加DOX组细胞迁移能力明显高于对照组;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭功能，通过细胞计数及结晶紫染色，结果表明，相对于对照组，加DOX组细胞的侵袭功能明显升高。
　　研究结论:
　　在293细胞中成功构建了稳定的Tet-On诱导表达系统，且诱导表达效果较为显著。构建重组质粒pTRE-Tight-TROP2，将其转染制各好的Tet-On-Advanced稳定细胞株，在诱导剂DOX作用下，成功诱导了TROP2蛋白的表达，并通过一系列实验证明TROP2蛋白在促进细胞增殖、迁移与侵袭能力上有显著作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 Tet-On诱导表达系统

1．1．1 Tet-On诱导表达系统的构成与作用机制

1．1．2 Tet-On诱导表达系统的优点

1．1．3 Tet-On诱导表达系统的应用

1．1．4 Tet-On诱导表达系统的展望

1．2 TROP2基因

1．3 本论文研究的目的、实验方案的设计、意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 实验方案的设计

1．3．3 研究意义

第二章 构建Tet-On-Advanced稳定转染株

2．1 材料与方法

2．1．1 细胞株及培养

2．1．2 载体与菌种

2．1．3 其他试剂、材料

2．1．4 主要溶液及其配制

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 G418最适筛选浓度的确定

2．2．2 真核细胞转染条件的优化

2．2．3 Tet-On-Advanced转染293，G418筛选单克隆株

2．2．4 RT-PCR法筛选Tet-On-Advanced阳性转染株

2．2．5 萤火虫荧光素酶检测试剂盒筛选稳定转染株

2．3 结果

2．3．1 G418最适筛选浓度的确定

2．3．2 真核细胞转染条件的优化

2．3．3 Tet-On-Advanced转染293，G418筛选单克隆株

2．3．4 RT-PCR法筛选转染阳性细胞

2．3．5 Tet-On-Advanced稳定转染细胞株的筛选

2．4 讨论

第三章 DOX调节293细胞TROP2蛋白的表达

3．1 材料与方法

3．1．1 细胞株及培养

3．1．2 载体与菌种

3．1．3 其他试剂、材料

3．1．4 主要溶液及其配制

3．1．5 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 构建重组载体pTRE-Tight-TROP2

3．2．2 DOX调节293细胞TROP2蛋白的表达

3．3 结果

3．3．1 构建重组载体pTRE-Tight-TROP2

3．3．2 DOX调节293细胞TROP2蛋白的表达

3．4 讨论

第四章 TROP2蛋白对细胞增殖、迁移与侵袭功能的作用

4．1 材料与方法

4．1．1 细胞株及培养

4．1．2 载体与菌种

4．1．3 其他试剂、材料

4．1．4 主要溶液及其配制

4．1．5 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 增殖实验

4．2．2 划痕实验

4．2．3 Transwell迁移实验

4．2．4 Transwell侵袭实验

4．2．5 数据处理与统计

4．3 结果

4．3．1 增殖实验检测细胞增殖功能

4．3．2 划痕实验检测细胞迁移功能

4．3．3 Transwell迁移实验检测细胞迁移功能

4．3．4 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭功能

4．4 讨论

第五章 主要结论与展望

5．1 主要结论

5．2 展望

参考文献

致谢

附录A：英文缩写索引

附录B：图表清单

附录C：攻读硕士学位期间参加的课题与发表的学术论文