海水养殖用抗生素氟苯尼考对水产养殖环境可持续安全影响的研究

摘要

水产品是我国食品构成的重要组成部分，而海水养殖是我国目前最主要的水产品供应方式。抗生素被广泛用于治疗和预防细菌性疾病。作为一种生态系统污染源，抗生素对水产品可持续安全造成了严重威胁。本文旨在评估抗生素对水产品的可持续安全影响，也为完善养殖用药使用规范提供理论依据。
　　本文以宁波市象山港近海养殖区与非养殖区（保护区）水样和表层沉积物为研究对象，通过可培养细菌计数、16S rRNA基因可变区的高通量测序、抗性基因和关键功能基因的qPCR检测等技术手段，构建了养殖区与保护区的微生物群落结构功能背景图谱;同时，通过微型生态模拟系统构建，对养殖区沉积物进行水产常用抗生素—氟苯尼考的单因素（50μg/ml）胁迫，从表型水平和分子水平两方面着手，在抗生素胁迫下，将水样和沉积物中微生物的群落结构、群落含有的抗性基因和基因水平转移元件的动态变化过程以更为直观、实时和定量的方式展现出来。主要结果如下:
　　1)养殖区水样中所含的氟苯尼考(FC)抗性细菌比例和相关的抗性基因和基因转移元件相对丰度均高于非养殖区水样。
　　2)养殖区沉积物中可培养微生物的氟苯尼考(FC)耐受性和沉积物中与FC相关的抗性基因和基因转移元件量均高于保护区;而养殖区沉积物中可培养微生物的代谢活性低于保护区。
　　3)通过16S rRNA基因高通量测序分析，发现在氟苯尼考(FC)处理第7d与对照组相比，沉积物微生物群落结构发生明显变化，而处理第28天，微生物群落结构组成已经基本恢复到处理前的水平。抗生素耐受检测发现处理第7d和第28d微生物群落中氟苯尼考(FC)耐受性与对照组相比均增加了128倍。而且通过实时荧光定量PCR检测发现在处理后第28d沉积物中与FC相关的抗性基因和基因转移元件量均高于对照组。
　　综上所述，海水养殖用抗生素投放会促进养殖区水样与沉积物中耐药细菌的积累，耐药基因的聚集以及传播扩散，使得海水养殖区水样和沉积物成为耐药基因的储存库与传播源头，对水产养殖环境可持续安全造成严重威胁。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 食品安全概述

1．2 水产养殖环境可持续安全现状

1．2．1 水产品是我国食品构成的重要组成部分

1．2．2 水产养殖业概述

1．2．3 海水养殖可持续安全面临的危机

1．3 海水养殖用抗生素对水产养殖环境可持续安全的影响

1．3．1 海水养殖用抗生素的使用现状

1．3．2 水产用抗生素的归趋

1．3．3 海水养殖用抗生素对水产养殖环境可持续安全的影响

1．4 研究方法

1．4．1 Microcosm—微型生态模拟系统

1．4．2 高通量测序技术

1．4．3 实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)技术

1．5 研究目的和意义、研究内容以及技术路线

1．5．1 研究目的和意义

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

第2章 氟苯尼考对养殖水体微生物耐药性的影响

2．1 前言

2．2 试验材料

2．2．1 试验试剂

2．2．2 主要仪器设备

2．3 试验方法

2．3．1 溶液配制

2．3．2 样品的采集

2．3．3 水样活细胞计数

2．3．4 水样DNA提取

2．3．5 荧光定量PCR引物的设计

2．3．6 水样FC抗性基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

2．4 试验结果与分析

2．4．1 海水样品中耐氟苯尼考微生物的数量与比例统计

2．4．2 水样FC抗性基因实时荧光定量PCR检测

2．5 本章小结与讨论

第3章 海水养殖区沉积物中微生物群落结构功能及其耐药性调查

3．1 前言

3．2 试验材料

3．2．1 试验试剂

3．2．2 主要仪器设备

3．3 试验方法

3．3．1 溶液配制

3．3．2 样品的采集以及预处理

3．3．3 沉积物中的可培养微生物和弧菌计数

3．3．4 沉积物样品FC的抗生素耐受(Antibiotic Tolerance)检测

3．3．5 沉积物中可培养微生物的功能多样性性测定

3．3．6 沉积物样品DNA提取

3．3．7 沉积物样品中FC抗性基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

3．3．8 高通量测序

3．3．9 试验数据统计分析

3．4．试验结果与分析

3．4．1 采样点信息以及沉积物理化性质检测

3．4．2 沉积物中可培养微生物统计分析

3．4．3 沉积物中可培养微生物的FC耐受检测

3．4．4 沉积物中可培养微生物的功能多样性分析

3．4．5 沉积物中FC抗性基因实时荧光定量PCR检测

3．4．6 高通量测序方法检测沉积物中微生物群落结构及组成

3．5 本章小结与讨论

第4章 氟苯尼考对养殖区沉积物中微生物群落结构和耐药性的影响

4．1 前言

4．2 试验材料

4．2．1 试验试剂

4．2．2 主要仪器设备

4．3 试验方法

4．3．1 样品的采集以及预处理

4．3．2 抗生素种类和处理浓度的确定

4．3．3 构建抗生素-沉积物微型模拟生态系统

4．3．4 取样

4．3．5 沉积物样品FC的抗生素耐受

4．3．6 沉积物样品DNA提取

4．3．7 沉积物中FC抗性基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

4．3．8 基于16S rRNA基因的高通量测序分析微生物群落的结构变化

4．3．9 试验数据统计分析

4．4 试验结果与分析

4．4．1 对照组和处理组沉积物中可培养微生物的抗生素耐受比较

4．4．2 沉积物中FC抗性基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测

4．4．3 高通量测序方法检测抗生素胁迫下沉积物微生物群落响应

4．5．本章小结与讨论

第5章 结论与展望

5．1 主要结论

5．2 工作展望

参考文献

致谢

在读学位期间发表的论文