RA患者血清免疫复合物对HUVEC生物活性的影响及其瓜氨酸化抗原的鉴定分析

摘要

研究目的:
　　类风湿关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病，其发病机制目前并不完全清楚。已发现在RA患者血清、关节滑膜液和软骨组织表层存在大量免疫复合物(immune complex，IC)，IC中含有大量瓜氨酸化蛋白质，如瓜氨酸化纤维蛋白原和瓜氨酸化波形蛋白等。IC可激活补体系统并促进细胞因子等炎性介质的释放，引起关节骨和软骨组织发生损伤，进而引起不可逆的关节畸变等功能损害。在RA发展过程中，一个重要的病理改变就是滑膜血管翳(pannus)的形成。RA的发生发展与血管翳密切相关，且血管翳形成的因素十分复杂，这可能是导致RA病程迁延，治疗困难的主要原因。本实验室前期研究发现，RA患者尤其是血清抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)阳性(ACPA+)患者血清ACPA特异性IC(ACPA-IC)水平显著升高，ACPA-IC在RA患者血清中出现可能具有重要的致病意义。本文拟在前期研究基础上，进一步研究RA患者血清IC(RA-IC)对人血管内皮细胞功能的影响，并用蛋白质组学技术对RA-IC中的瓜氨酸化抗原成分进行鉴定。
　　研究方法:
　　1.标本来源本实验中血清标本取自南京军区南京总医院门诊及住院患者，RA患者10例，均为血清ACPA阳性;SLE患者10例和体检健康者对照10例均为血清ACPA阴性。RA诊断均符合美国风湿病学学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)2010年修订的RA分类标准[8];SLE诊断均符合SLE国际临床协作组(SLICC)2009年修订的SLE分类标准[8]。标本收集均获得患者及主管医师知情同意。
　　2.IC提取及鉴定。用G蛋白免疫亲和层析法分别从RA患者、SLE患者及正常对照血清中提取IC。化学发光免疫分析法、western blot方法分别对RA患者IC（RA-IC）中ACPA和瓜氨酸化抗原进行初步鉴定。
　　3.RA-IC对人血管内皮细胞(HUVEC)生物学功能的影响。取对数生长期HUVEC细胞，分别用RA患者血清IC(RA-IC)、SLE患者血清IC(SLE-IC)、健康人血清IC(C-IC)刺激HUVEC，培养24h后，用CCK-8细胞增殖法检测其增殖水平，Transwell小室法检测细胞迁移情况。
　　4.用兔抗瓜氨酸化抗体免疫共沉淀法纯化RA-IC中瓜氨酸化免疫复合物，Thermo-fisher LTQ-Orbitrap高精度液质联用型质谱技术鉴定RA-IC中的抗原成分。
　　研究结果:
　　1.用G蛋白柱免疫亲和层析法从RA及对照组血清中纯化出纯度较高的抗原抗体IC;western blot法鉴定发现，与对照组IC(SLE-IC、C-IC)相比，RA-IC中含有与兔抗瓜氨酸抗体相结合的抗原成分。
　　2.与SLE-IC、C-IC相比，RA-IC在一定浓度下，能显著促进HUVEC增殖和迁移。
　　3.RA-IC经兔抗瓜氨酸化抗体免疫共沉淀后，用Thermo-fisher LTQ-Orbitrap高精度液质联用型质谱技术进行抗原成分鉴定，发现在RA-IC中5种特异性抗原。
　　结论:
　　ACPA+RA患者血清IC能显著促进HUVEC增殖及迁移功能。免疫共沉淀技术质谱分析技术对RA患者血清中瓜氨酸化蛋白进行了鉴定，这些蛋白分子可能在RA患者IC形成及其免疫病理机制中发挥一定作用。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

第一章 绪论

1．1 IC与RA

1．2 血管生成与RA

1．3 蛋白质组学在RA中的应用

1．4 本研究的目的、方法、实验设计、意义

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究方法

1．4．3 试验设计

1．4．4 研究意义

第二章 血清IC的提纯和鉴定及其对HUVEC功能的影响

2．1 实验材料

2．1．1 标本来源

2．1．2 细胞

2．1．3 主要试剂

2．1．4 溶液配制

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 G蛋白免疫亲合层析法纯化血清IC

2．2．2 SDS—PAGE电泳

2．2．3 western blot

2．2．4 HUVEC培养

2．2．5 ACPA测定

2．2．6 细胞增殖水平测定(CCK-8法)

2．2．7 细胞迁移试验

2．3 实验结果

2．3．1 IC纯化结果

2．3．2 IC中瓜氨酸化蛋白质的鉴定

2．3．3 IC中ACPA的鉴定

2．3．4 RA-IC刺激对HUVEC增殖功能的影响

2．3．5 细胞迁移实验

2．4 讨论

第三章 RA-IC中瓜氨酸化抗原成分的鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 标本来源

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要试剂配制方法

3．1．4 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 G蛋白免疫亲合层析法纯化血清IC

3．2．2 免疫共沉淀法纯化RA-IC

3．2．3 硝酸银染色

3．2．4 强阳离子交换色谱(HPLC)

3．2．5 肽段的纯化(C18反相色谱除盐)

3．2．6 质谱检测

3．2．7 蛋白质定性分析

3．3 实验结果

3．3．1 SDS-PAGE硝酸银染色结果

3．3．2 质谱鉴定结果

3．4 讨论

第四章 主要结论及展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表文章

致谢