HELA荷瘤鼠MDSC与HMGB1的检测及恩度体外抗瘤作用研究

摘要

目的:
　　本研究通过检测小鼠宫颈癌移植瘤模型中HMGB1和髓源性抑制细胞(MDSC)的表达水平，分析两者在肿瘤微环境中的相关性及作用;同时，探讨缺氧情况下，重组人血管内皮抑制素(恩度)体外诱导Hela宫颈癌细胞凋亡的机制，为宫颈癌免疫干预治疗提供理论依据。
　　方法:
　　1.人宫颈癌Hela细胞系建立裸鼠皮下种植瘤模型，成瘤后取荷瘤小鼠的脾脏、肿瘤组织及外周血制成单细胞悬液，通过流式细胞术(FCM)检测脾脏、外周血中MDSC细胞的百分比例。
　　2.分别采用Western blotting、RT-qPCR方法检测癌和癌旁组织中HMGBl蛋白和mRNA的表达水平。
　　3.通过Percoll密度梯度离心法和免疫磁珠分选法，分离、纯化荷瘤鼠脾脏来源的MDSC细胞，RT-qPCR检测纯化后的MDSCs自身Arg-1和iNOS的mRNA表达水平。
　　4.体外培养人宫颈癌HeLa细胞，在低氧的环境下分别给予以下处理24小时:PBS、恩度、恩度联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)，通过Hoechst33258染色及Annexin V-FITC/PI双染结合FCM检测Hela细胞的凋亡水平，Western blotting检测微管相关蛋白轻链3(LC-3)、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax的表达。
　　结果:
　　1.与正常对照组相比，荷瘤鼠外周血和脾脏中CD11b+Gr-1+MDSC的比例明显增高(p＜0.05)。与癌旁组织对照组相比，荷瘤鼠肿瘤组织中HMGB1呈明显高表达，具有统计学意义(p＜0.05)。荷瘤鼠脾脏中CD11 b+Gr-1+MDSC％增高与肿瘤组织中HMGB1的高表达呈正下相关。
　　2.免疫磁珠分选法纯化MDSCs的纯度明显优于Percoll密度梯度离心法，纯度可达89％左右。与正常鼠相比，从荷瘤鼠组分离出的MDSCs自身明显高表达Arg-1和iNOS，具有统计学意义(p＜0.01)。
　　3.Hoechst33258染色提示恩度在低氧环境下可以诱导Hela细胞出现核碎裂，说明诱导了细胞的凋亡;同样的，Annexin V-FITC/PI染色结合FCM检测发现恩度处理组诱导细胞凋亡率明显高于另两组;Western blotting跟其结果相一致，与另两组相比，恩度处理HeLa细胞后，LC-3及Bax蛋白表达水平明显升高且Bcl-2蛋白表达降低。
　　结论:
　　宫颈癌肿瘤微环境中，HMGB1的高表达与MDSCs的累积数量呈正相关，且与正常鼠相比，荷瘤鼠中MDSCs过表达免疫抑制介质iNOS和Arg-1，因此，HMGB1可能通过调控MDSCs功能参与宫颈癌的免疫逃逸;另外，在低氧坏境下，恩度可以诱导Hela宫颈癌细胞的凋亡，而且其凋亡机制与细胞自噬有关，是以潜在的抗瘤药物。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 绪论

1．1 研究背景及意义

1．2 MDSCs的概述

1．3 HMGB1的概述

1．4 重组人血管内皮抑素

1．5 本研究的目的、方法、实验方案设计及研究意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 实验方法

1．5．3 实验方案设计

1．5．4 研究意义

第二章 肿瘤微环境中HMGB1与MDSC检测及相关性分析

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 手术器械以及相关耗材

2．1．4 细胞株

2．1．5 实验动物

2．2 实验方法

2．2．1 细胞复苏、培养和传代

2．2．2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

2．2．3 荷瘤鼠的脾脏、肿瘤组织细胞悬液的制备及外周血单个核细胞的制备

2．2．4 流式细胞术检测Gr-1+CD11b+MDSCs

2．2．5 细胞总RNA的提取

2．2．6 逆转录反应

2．2．7 Real Time PCR

2．2．8 Western blot蛋白印迹

2．2．9 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．1 荷瘤鼠生存状况分析

2．3．2 CD11b+Gr-1+MDSC％检测

2．3．3 HMGB1在肿瘤组织及癌旁组织中的表达情况

2．3．4 HMGB1与MDSC相关性分析

2．4 讨论

第三章 MDSC的分离、纯化以及相关介质的检测

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 手术器械以及相关耗材

3．1．4 细胞株

3．1．5 实验动物

3．2 实验方法

3．2．1 裸鼠皮下荷瘤模型建立

3．2．2 裸鼠脾脏细胞悬液的制备

3．2．3 MDSCs的分离和纯化

3．2．4 流式细胞术鉴定CD11b+Gr1+MDSC细胞的比例

3．2．5 荧光定量PCR检测MDSC细胞中Arg-1、iNOS的mRNA表达

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 恩度诱导HeLa细胞凋亡的机制研究

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．3 相关耗材

4．1．4 细胞株

4．2．实验方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 细胞处理

4．2．3 Hoechst 33258染色观察细胞核形态

4．2．4 FITC-AnnexinV／PI双染色检测HeLa细胞凋亡率

4．2．5 Western blot蛋白印迹

4．2．6 图像与统计学分析

4．3．实验结果

4．3．1 HeLa细胞核的荧光染色结果

4．3．2 FCM检测恩度诱导Hela细胞的凋亡率

4．3．3 Western Blot法检测凋亡相关蛋白表达水平

4．4 讨论

主要结论

参考文献

综述 髓源性抑制细胞在肿瘤微环境中的作用研究

致谢

攻读硕士期间发表文章