弓形虫ROP18调控宿主细胞凋亡的线粒体途径机制研究

摘要

目的:
　　将表达刚地弓形虫ROP18的真核表达载体在293T细胞中表达，研究弓形虫ROP18对宿主细胞凋亡的影响，并探讨其调控细胞凋亡的机制。
　　方法:
　　复苏实验室已构建的含有p3XFLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18质粒的菌株，以无内毒素质粒大量提取试剂盒提取质粒。使用阳离子聚合物RonfectTM将质粒转染至293T细胞中，于24h、36h、48h、60h收集转染后细胞，用抗c-myc标签抗体Wensternblotting技术检测不同时间点ROP18的表达量。
　　24孔或6孔培养板中接种293T细胞，分别设对照组和转染组，培养24 h后向转染组细胞中转染ROP18。使用0.5μg/ml放线菌素D(Act D)处理细胞24h从而诱导凋亡。于转染后24h、36h、48h、60h收集细胞，分别检测以下指标。
　　将细胞用AnnexinⅤ-FITC/PI染色，以流式细胞术检测细胞凋亡率。
　　将细胞线粒体与胞质分离，用Western blotting检测细胞色素C在线粒体与胞质中的分布。细胞经JC-1染色后，流式细胞术检测细胞线粒体跨膜电位。
　　提取标本中RNA并反转录为cDNA，实时荧光定量PCR检测细胞Bcl-2基因及Bax基因的拷贝数并计算两者比值。
　　结果:
　　转染后24h、36h、48h、60h的细胞，Western blotting均能检测出55 kDa处特异性条带，与ROP18分子量大小相同，且ROP18表达量由24h至60h呈递增趋势。
　　转染后24h、36h、48h，ROP18转染组细胞凋亡率均低于未转染组，其中48h两组差别有统计学意义(P＜0.05)，60h两组凋亡率无差异。
　　转染24h、36h后细胞线粒体细胞色素C含量ROP18转染组高于未转染组(P＜0.05)，而细胞胞浆中细胞色素C含量低于未转染组(P＜0.05)。转染24h、36h后线粒体跨膜电位ROP18转染组高于未转染组(P＜0.05)。
　　转染后36h、48h、60h，ROP18转染组Bcl-2与Bax比值明显高于未转染组(P＜0.05)。
　　结论:
　　在宿主细胞中成功表达弓形虫ROP18蛋白。弓形虫ROP18能抑制宿主细胞凋亡。其机制是弓形虫通过分泌ROP18，上调宿主细胞Bcl-2/Bax比值，阻止细胞色素C释放和线粒体跨膜电位耗散，保护宿主细胞线粒体膜完整性，从而调控宿主细胞凋亡的线粒体途径。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

第一章 绪论

1．1 弓形虫的致病机制

1．2 细胞凋亡和凋亡的线粒体通路

1．3 弓形虫感染抑制宿主细胞凋亡

1．4 ROP18的研究现状

1．5 本研究的意义

第二章 弓形虫p3XFLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18在宿主细胞中表达

2．1 实验仪器和材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验耗材

2．1．3 实验试剂

2．1．4 试剂配制

2．1．5 菌种与细胞株

2．2 实验方法

2．2．1 p3XFLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18的大量提取

2．2．2 293T细胞的复苏与传代

2．2．3 p3XFLAG-Myc-CMVTM-24-ROP18转染293T细胞

2．2．4 Western blotting法检测ROP18的表达

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 弓形虫ROP18对宿主细胞凋亡的影响

3．1 实验仪器与材料

3．1．1 实验仪器

3．1．2 实验耗材

3．1．3 实验试剂

3．1．4 试剂配制

3．1．5 细胞

3．2 实验方法

3．2．1 293T细胞的复苏和传代

3．2．2 293T细胞的转染与凋亡诱导

3．2．3 Annexin V-FITC／PI法检测293T细胞凋亡

3．2．4 数据统计

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 弓形虫ROP18对宿主细胞线粒体损伤的保护作用

4．1 实验仪器与材料

4．1．1 实验仪器

4．1．2 实验耗材

4．1．3 实验试剂

4．1．4 细胞

4．2 实验方法

4．2．1 293T细胞的复苏和传代

4．2．2 Western blotting法检测细胞色素C在细胞线粒体与胞浆内的分布

4．2．3 JC-1法检测线粒体跨膜电位

4．3 结果

4．3．1 细胞色素C在线粒体、胞浆的分布

4．3．2 JC-1检测细胞线粒体跨膜电位结果

4．4 讨论

第五章 弓形虫ROP18调控宿主细胞凋亡的线粒体途径机制

5．1 实验仪器与材料

5．1．1 实验仪器

5．1．2 实验耗材

5．1．3 实验试剂

5．1．4 试剂配制

5．1．5 细胞

5．2 实验方法

5．2．1 293T细胞的铺板

5．2．2 293T细胞的转染与凋亡诱导

5．2．3 293T细胞RNA的提取

5．2．4 cDNA的合成

5．2．5 Bcl-2、Bax标准品的制备

5．2．6 实时荧光定量PCR绝对定量法测定Bcl-2、Bax拷贝数

5．3 结果

5．3．1 PCR扩增bcl-2与bax基因结果

5．3．2 载体pTG19-T-Bcl-2与pTG19-T-Bax鉴定结果

5．3．3 实时荧光定量PCR结果

5．4 讨论

结论与展望

参考文献

致谢

在学期间发表的论文及参加课题