RAD18基因敲除通过抑制FA/BRCA通路增强肺癌细胞对顺铂的敏感性

摘要

目的:应用siRNA手段敲除人肺非小细胞肺癌A549/DDP细胞株（顺铂耐药A549细胞株）和A549细胞株的E3泛素连接酶RAD18基因后，研究该处理对顺铂敏感性变化产生的影响，探讨非小细胞肺癌细胞对顺铂耐药机制中FA/BRCA通路的作用。
　　方法:订购针对RAD18基因的siRNA(RAD18-siRNA)，通过脂质体转染技术将RAD18-siRNA分别导入人肺非小细胞肺癌细胞A549/DDP和A549细胞株达到基因敲除目的，蛋白质印迹法（Western Blotting）检测经顺铂处理后，这一对细胞株转染处理前后RAD18蛋白的表达水平从而验证该基因是否被沉默。CCK-8法用于测定RAD18基因敲除前后，经顺铂处理的这一对细胞株的增殖率变化情况;Western Blotting分别测定RAD18基因敲除前后，这一对细胞株FANCD2蛋白单泛素化程度的变化;应用免疫荧光染色技术检测RAD18基因敲除前后，这一对细胞株胞核内FANCD2核聚小体的形成状态;AnnexinⅤ/PI双染，运用流式细胞术测定RAD18基因敲除前后这一对细胞株经质量浓度为10μg/mL的顺铂处理48小时，早期凋亡率的变化。
　　结果:(1)与转染前相比，RAD18-siRNA转染后A549/DDP和A549细胞的RAD18蛋白表达量明显降低(P＜0.05)，证明RAD18-siRNA转染有效，该基因被成功敲除。(2)RAD18基因敲除前后的A549/DDP和A549细胞增殖率变化呈剂量依赖性，随顺铂浓度的增加而明显下降，不同时间点的不同浓度之间，其细胞增殖率之间均存在差异，且差异有统计学意义(P＜0.05)。对于RAD18基因敲除后的A549/DDP以及A549细胞，除了经0和1.25μg/mL这两个浓度的顺铂处理外，其余各浓度顺铂处理后的细胞增殖率在24 h和48 h均明显低于基因未敲除时的细胞增殖率(P＜0.05)。(3) RAD18基因敲除后的A549/DDP和A549这一对细胞经顺铂处理24h和48h的IC50值（半数抑制浓度）较基因未敲除前显著降低(P＜0.05）。(4) RAD18基因敲除后，A549/DDP和A549这一对细胞株的FANCD2蛋白的表达水平明显下降（P均＜0.05），结果暗示了这一对肺癌细胞FA/BRCA通路的核心蛋白FANCD2合成呈现减少的趋势。同时敲除该基因后，除A549细胞在10μg/mL顺铂浓度处理24 h的FANCD2-L/S比值与未敲除时差异无统计学意义外（t=2.457，P=0.070），其余各浓度顺铂处理的这一对肺癌细胞24h后的FANCD2-L/S比值均较未敲除时明显降低（均P＜0.05），实验表明经过RAD18基因敲除后，FANCD2的单泛素化程度显著下降。(5)免疫荧光显色结果表明，A549/DDP和A549这一对细胞株经过浓度为5μg/mL顺铂处理24h和48h以后，细胞核中FANCD2核聚小体的形成增多，提示核聚小体形成;RAD18基因敲除后，这一对细胞株经过浓度为5μg/mL顺铂处理24 h时的细胞核内FANCD2核聚小体形成减少，表明这两个肺癌细胞株FA/BRCA通路的激活受到抑制。(8)AnnexinⅤ/PI双染，流式细胞术测定结果显示，分别敲除A549/DDP和A549细胞内RAD18基因后，用10μg/mL顺铂处理48 h的细胞早期凋亡率较未敲除时明显增加（P均＜0.05），表明该基因敲除后顺铂对这两个肺癌细胞的细胞毒性明显增强。
　　结论:应用RNA干扰技术分别敲除A549/DDP和A549细胞的RAD18基因，可以通过下调FANCD2的单泛素化程度，阻断FA/BRCA通路参与的DNA损伤修复机制，进而增加这一对细胞株对顺铂的敏感程度。同样，将顺铂耐药的肺癌细胞株（A549/DDP细胞）的RAD18基因进行敲除以后，结果表明也明显增强了其对顺铂的敏感性。说明这种干预可以逆转耐药肺癌细胞对顺铂产生的耐药性。我们的研究将为今后临床上应用基因转染技术敲除与顺铂耐药相关的靶基因，从而提高顺铂对耐药肺癌患者的治疗效果提供实验依据。

目录

声明

摘要

英文缩写索引

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 论文研究目的、实验方法、实验方案的选择和临床意义

1．2．1 研究目的

1．2．2 研究主要内容和方法

1．2．3 实验方案的设计

1．2．4 研究的临床意义

第二章 RAD18-siRNA转染、验证转染效果，转染对A549／DDP和A549细胞增殖率的影响

2．1 实验对象、仪器与材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 实验基本仪器

2．1．3 实验主要试剂

2．1．4 实验基本试剂配方

2．2 实验方法与主要流程

2．2．1 细胞培养与收集

2．2．2 RAD18-siRNA转染、Western blotting法测定转染后肺癌细胞RAD18蛋白表达水平

2．2．3 CCK-8法测定RAD18-siRNA转染前后顺铂诱导的细胞增殖率

2．2．4 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．1 转染RAD18-siRNA前后A549／DDP和A549细胞内RAD18蛋白的表达水平

2．3．2 转染RAD18-siRNA前后A549／DDP和A549细胞增殖率变化

2．3．3 转染RAD18-siRNA前后肺癌A549／DDP和A549细胞的IC50值

2．4 实验结果分析

第三章 转染RAD18-siRNA对A549／DDP和A549细胞凋亡率的影响

3．1 实验所需主要材料与实验技术

3．1．1 细胞株

3．1．2 实验基本仪器

3．1．3 实验主要试剂

3．1．4 实验基本试剂及配制方法

3．2 实验操作方法

3．2．1 细胞处理与实验主要步骤

3．2．2 流式细胞技术主要步骤

3．2．3 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．1 A549／DDP和A549细胞转染RAD18-siRNA前后细胞早期凋亡率改变

3．4 实验结果分析

第四章 转染RAD18-siRNA对A549／DDP和A549细胞FANCD2单泛素化及FANCD2核聚小体形成的影响

4．1 实验所需主要材料与实验技术

4．1．1 细胞株

4．1．2 实验基本仪器

4．1．3 实验主要试剂

4．1．4 实验基本试剂及配制方法

4．2 实验操作方法

4．2．1 Western blotting测定RAD18-siRNA转染前后FANCD2蛋白表达与单泛素化水平

4．2．2 免疫荧光实验测定细胞核内FANCD2核聚小体表达

4．2．3 统计学分析

4．3 实验结果

4．3．1 转染RAD18-siRNA前后A549／DDP和A549细胞FANCD2蛋白表达及其单泛素化水平

4．3．2 转染RAD18-siRNA前后A549／DDP和A549细胞FANCD2核聚小体的表达

4．4 实验结果分析

讨论

结论与展望

参考文献

综述 RNA干扰技术在FA／BRCA通路研究的中应用

致谢

攻读硕士期间发表文章