小麦麸皮α--葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及其对2型糖尿病的干预

摘要

最新的研究报告指出，中国的糖尿病患者人数已达1.14亿，其中90～95％为2型糖尿病患者，2型糖尿病已成为影响国人健康的最主要的非传染性慢性疾病之一。由于目前的治疗药物大多价格昂贵且具有一定的副作用，因此食物干预2型糖尿病研究具有重要意义。小麦麸皮是面粉加工的副产品，其来源丰富、价格低廉，近年来的流行病学调查显示其可有效预防2型糖尿病的发生，但是降糖功能因子尚未完全阐明。本文以2型糖尿病治疗靶点之一α-葡萄糖苷酶的抑制活性为检测指标，分离纯化小麦麸皮中的α-葡萄糖苷酶抑制剂，并研究其抑制作用机制及其对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的干预作用。本研究将为小麦麸皮降糖功能因子的阐明提供新的思路，为小麦麸皮作为健康食品资源进一步推广利用提供理论依据。主要研究内容和结果如下: (1)小麦麸皮α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离和鉴定。结果显示:小麦麸皮95％乙醇提取物(WBE)具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，WBE依次采用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，其中石油醚萃取物(WBEP)的得率和对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均明显高于其它四个萃取产物。WBEP进一步采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析分离纯化后得活性物质F3-17和F13-26，经液质联用技术(LC/MS)分析鉴定为芹菜素(AP)和烷基间苯二酚同系物(ARs)。 (2)AP、ARs对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学研究。分别采用对硝基-α-D-葡萄糖苷(pNPG)、蔗糖、麦芽糖为底物，测定AP、ARs对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，AP的半抑制浓度(IC50)分别为14.48、137.32、165.35μg/mL，ARs的IC50值分别为37.58、566.78、542.90μg/mL。利用米氏方程(Michaelis-Menton)和双倒数作图法(Lineweaver-Burk plot)，研究AP、ARs对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，发现AP为竞争性抑制剂，对以NPG、蔗糖、麦芽糖为底物的α-葡萄糖苷酶的抑制常数Ki分别为12.08、36.65、28.55μg/mL; ARs对以NPG、麦芽糖为底物的α-葡萄糖苷酶的抑制为非竞争性抑制，Ki值分别为17.24、591.19μg/mL。ARs对以蔗糖为底物的α-葡萄糖苷酶的抑制为混合型抑制，Ki值以及Ksi值分别为1808.63、1158.63μg/mL。 (3)采用荧光猝灭实验和分子对接模拟研究AP、ARs抑制α-葡萄糖苷酶的分子作用机制。研究表明，AP、5-二十一烷基间苯二酚（小麦麸皮ARs中含量最高的一种单体）对α-葡萄糖苷酶的内源性荧光具有猝灭作用，其作用类型属于静态猝灭。AP对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭常数KA为0.8594×104L/mol(298 K)、0.6177×104L/mol(304 K)和0.4865×104L/mol(310 K)，反应的热力学参数显示AP和α-葡萄糖苷酶主要以疏水作用力结合;5-二十一烷基间苯二酚对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭常数KA为0.2012×104 L/mol(298 K)、0.0237×104L/mol(304 K)、0.0103×104L/mol(310 K)，反应的热力学参数显示5-二十一烷基间苯二酚和α-葡萄糖苷酶主要以疏水作用力结合。分子对接实验显示芹菜素、5-二十一烷基间苯二酚在α-葡萄糖苷酶上的结合部位，表明其竞争性、非竞争性抑制作用的分子机制，并显示分子间的作用力主要是疏水作用和氢键。 (4)采用高脂高糖饮食联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导的2型糖尿病小鼠模型，研究AP、ARs对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的干预。研究结果显示:AP、ARs显著降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖值(FBG)，改善小鼠的葡萄糖耐量(p＜0.05);显著降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)的含量，显著增加高密度脂蛋白(HDL)的含量(p＜0.05)。 (5)AP、ARs干预2型糖尿病小鼠糖脂代谢的机制研究。结果表明:AP、ARs能显著降低2型糖尿病小鼠的血清胰岛素含量(FINS)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)(p＜0.05);改善2型糖尿病小鼠受损的胰腺、肾脏、脾脏的组织形态，胰腺组织的超微切片电镜观察结果进一步显示AP、ARs对胰岛细胞的保护作用;ARs可显著增加肝糖原和肌糖原的含量(p＜0.05)，极显著增加肝脏葡萄糖激酶(GK)活性(p＜0.01)。AP显著增加肝脏葡萄糖激酶(GK)活性(p＜0.05); AP、ARs显著增强小鼠血清、肝脏和肌肉的总抗氧化能力(T-AOC)(p＜0.05)，其中高浓度ARs极显著地增强肝脏T-AOC值(p＜0.01); AP、ARs极显著降低血清和肝脏丙二醛(MDA)水平(p＜0.01)，显著降低骨骼肌MDA水平(p＜0.05);高浓度AP显著提高肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性(p＜0.05)，ARs极显著提高血清、肝脏和骨骼肌SOD活性(p＜0.01)。AP显著增加血清、骨骼肌过氧化氢酶(CAT)活性，极显著增加肝脏CAT活性。ARs显著增加血清、骨骼肌CAT活性(p＜0.05)，极显著增加肝脏CAT活性（其中高浓度ARs极显著增加血清CAT活性）;AP极显著提高血清、肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性(p＜0.01)，显著提高骨骼肌GSH-Px活性(p＜0.05)。ARs极显著提高血清、肝脏和骨骼肌GSH-Px活性(p＜0.01)。由此可见，AP、ARs通过改善2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗(IR)、修复受损组织器官、增强肝脏对葡萄糖的转化能力以及提高血清、肝脏、骨骼肌的抗氧化能力来干预糖脂代谢。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 糖尿病概述

1．1．1 糖尿病及其分类

1．1．2 2型糖尿病的发病机制

1．1．3 2型糖尿病的干预研究进展

1．2 α-葡萄糖苷酶抑制剂与2型糖尿病干预

1．2．1 α-葡萄糖苷酶抑制剂简介

1．2．2 天然产物中的α-葡萄糖苷酶抑制剂研究进展

1．2．3 α-葡萄糖苷酶抑制剂的降糖机制

1．3 小麦麸皮的降糖作用研究

1．3．1 小麦麸皮的开发研究现状

1．3．2 小麦麸皮中的降糖功能因子研究

1．3．3 小麦麸皮的降糖机制研究进展

1．4 论文的立题依据及主要研究内容

第2章 小麦麸皮α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离纯化与鉴定

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 试剂的配制

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 小麦麸皮提取物的制备

2．2．2 小麦麸皮α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

2．2．3 小麦麸皮提取物对α-葡萄糖苷酶的IC50值测定

2．2．4 小麦麸皮醇提物的制备及系统溶剂分离活性组分

2．2．5 小麦麸皮醇提物石油醚萃取部位的硅胶柱层析分离

2．2．6 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性流分的Ms分析

2．2．7 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性流分的凝胶柱层析分离

2．2．8 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性组分的紫外吸收波长测定

2．2．9 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性组分的HPLC分析

2．2．10 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性组分的LC／MS分析

2．2．11 实验数据统计与分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 小麦麸皮不同浸提物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

2．3．2 95％乙醇提物的制备及溶剂系统分离

2．3．3 小麦麸皮醇提物各极性部位萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

2．3．4 硅胶柱层析分离纯化小麦麸皮醇提物石油醚萃取部位

2．3．5 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性流分的Ms分析

2．3．6 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性流分3和13的凝胶柱层析分离

2．3．7 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性组分F3-17和F13-26的紫外-可见全波长扫描

2．3．8 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性组分F3-17和F13-26的HPLC分析

2．3．9 具有抑制α-葡萄糖苷酶活性组分F3-17和F13-26的LC／MS分析

2．4 本章小结

第3章 芹菜素和烷基苯二酚同系物对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学研究

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 试剂的配制

3．1．4 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 鼠肠α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

3．2．2 不同浓度抑制剂对酶促反应的影响

3．2．3 AP、ARs的抑制动力学测定

3．3．结果与讨论

3．3．1 AP对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3．3．2 ARs对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3．3．3 AP对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数

3．3．4 ARs对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数

3．4 本章小结

第4章 芹菜素、烷基间苯二酚同系物抑制α-葡萄糖苷酶的分子作用机制

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 实验试剂

4．1．2 试剂的配制

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 AP、5-二十一烷基问苯二酚对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭作用

4．2．2 AP、5-二十一烷基问苯二酚对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭类型分析

4．2．3 AP、5-二十一烷基间苯二酚对α-葡萄糖苷酶的相互作用类型分析

4．2．4 α-葡萄糖苷酶的同源建模

4．2．4 分子对接模拟AP、5-二十一烷基间苯二酚与α-葡萄糖苷酶的相互作用

4．3 结果与讨论

4．3．1 AP、5-二十一烷基间苯二酚对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭光谱

4．3．2 AP、5-二十一烷基间苯二酚与α-葡萄糖苷酶相互作用力分析

4．3．3 α-葡萄糖苷酶同源建模结果

4．3．4 AP、5-二十一烷基间苯二酚与α-葡萄糖苷酶的分子对接模拟

4．4 本章小结

第5章 芹菜素和烷基间苯二酚同系物对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的干预研究

5．1 实验材料与仪器

5．1．1 实验动物

5．1．2 实验试剂

5．1．3 试剂的配制

5．1．4 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 2型糖尿病小鼠模型的建立

5．2．2 实验动物的分组和给药

5．2．3 小鼠生存状态的观察

5．2．4 空腹血糖值的测定

5．2．5 口服葡萄糖耐量的测定

5．2．6 血清生化指标的测定

5．2．7 数据统计与分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 AP、ARs对2型糖尿病小鼠的生活状态的改善

5．3．2 AP、ARs对2型糖尿病小鼠空腹血糖值的影响

5．3．3 AP、ARs对2型糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影响

5．3．4 AP、ARs干预对2型糖尿病小鼠血脂的影响

5．4 本章小结

第6章 芹菜素和烷基间苯二酚同系物干预2型糖尿病的机制研究

6．1 实验材料与仪器

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验试剂

6．1．3 试剂的配制

6．1．4 主要仪器

6．2 实验方法

6．2．1 血清胰岛素含量的测定以及胰岛素抵抗指数计算

6．2．2 小鼠脏器／组织的获取

6．2．3 肝脏、肌肉组织糖代谢的变化

6．2．4 小鼠脏器指数的测定方法

6．2．5 组织病理学观察

6．2．6 胰腺细胞超微结构观察

6．2．7 机体抗氧化水平的测定

6．2．8 数据统计与分析

6．3 结果与讨论

6．3．1 AP、ARs对小鼠血清胰岛素水平及胰岛素抵抗的影响

6．3．2 AP、ARs对2型糖尿病小鼠肝脏、骨骼肌糖代谢的影响

6．3．3 AP、ARs对2型糖尿病小鼠组织器官的保护作用

6．3．4 AP、ARs对2型糖尿病小鼠抗氧化能力的影响

6．4 本章小结

第7章 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 工作不足之处以及工作展望

7．2．1 工作不足之处

7．2．1 工作展望

创新点

参考文献

学习期间发表的论文与专利申请

致谢