耶罗维亚酵母对葡萄上OTA产生菌株的拮抗作用及其机制的初步研究

摘要

赭曲霉毒素(OTA)为一种由青霉属霉菌等代谢生成的一种有毒的次级代谢物。赭曲霉毒素被证实对实验动物身体具有多种毒副作用，如致突变性、致畸性等，所以对人类和动物的身体安全存在巨大的负面危害。
　　利用物理方法控制葡萄及其制品中OTA污染，抑制水果表面致病霉菌的生长繁殖或降低已经产生的赭曲霉毒素含量，但不能将OTA彻底地去除。而化学方法虽然具有高效性，但安全性问题堪忧。拮抗生物防治法是一种对环境无污染、对动植物健康无威胁的方法，被认为是现阶段最具有发展前景的无公害方法。拮抗生物处理法是利用某些有益微生物对真菌具有很强的抑制作用，或者对毒素具有降解作用。尤其是成为重点研究对象的酵母菌类真菌，其代谢产物中一般没有对人体有毒有害的物质，安全性相对细菌更安全，且酵母菌的遗传物质相对稳定、细胞效价高、对不适宜生长的逆境环境下也具有一定的耐受性，同时酵母菌细胞可以与化学药剂及物理处理共同发挥作用。所以拮抗酵母菌发展为生物防治法中的主要研究目标。
　　本研究论文采用我们课题组实验室已经筛选分离并鉴定的耶罗维亚酵母（Y.lipolytica）为研究对象，探究了Y.lipolytica对由OTA产生菌O-1引起的葡萄采后果实青霉病害的生物抗病效果，在体内试验中探究了葡萄果实自然腐烂率及浆果各种贮藏品质指标的作用，初步研究了Y.lipolytica抑制OTA产生菌O-1生长繁殖的生理机制及Y.lipolytica体外抑制OTA产生菌的生长繁殖及其降解OTA的分子机制。主要研究结果如下:
　　1.利用高效液相荧光检测法和紫外荧光检测法相结合的方法，从病害葡萄的表面、果肉组织中分离并筛选到几株OTA产生菌株，测序分析其中产毒素含量最高的一株霉菌O-1的5.8S rDNA-ITS区的基因序列，并对其形态学进行了鉴定。
　　2.不同的气候影响着赭曲霉毒素产生菌的种类及其OTA浓度，对葡萄制品的污染状况也有很大的影响，研究不同的碳源、氮源、无机盐、pH、温度等因素对产毒菌株O-1的生长和产毒素含量的影响发现，培养条件不同，岛青霉O-1菌丝生长和产毒素能力也不同。
　　3.Y.lipolytica能够有效控制由产毒素菌株P.islandicum引起的产后葡萄病害，降低青霉病的发病率，减少葡萄产后损失，并对果实的贮藏品质没有不良影响。Y.lipolytica抑制产毒素菌株O-1的生理机制包括以下几方面:Y.lipolytica能迅速在葡萄创伤处生长繁殖，同霉菌P.islandicum O-1竞争伤口处的营养和空间;在体外培养基试验处理中Y.lipolytica能有效地抑制P.islandicum的菌丝体的延伸和霉菌孢子的芽管的萌发。
　　4.通过蛋白质组学技术，对Y.lipolytica与P.islandicum O-1共同培养条件下，对霉菌蛋白的影响作了分析，发现霉菌菌丝中与基础代谢相关的蛋白均被酵母菌细胞抑制。对Y.lipolytica降解OTA20h后酵母细胞蛋白进行了分离、比较和鉴定。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 赭曲霉毒素A的概述

1．1．1 OTA理化性质

1．1．2 OTA的危害及限量标准

1．2 赭曲霉毒素A来源及其在葡萄制品中的污染

1．2．1 OTA的来源

1．2．2 OTA在各类葡萄制品中的污染现状

1．3 葡萄和葡萄饮品中OTA的检测方法

1．3．1 OTA的提取和净化方法

1．3．2 OTA的检测方法

1．4 拮抗酵母菌对葡萄OTA污染控制的研究进展

1．4．1 控制葡萄上OTA污染的传统方法

1．4．2 拮抗酵母菌对葡萄表面致病霉菌的生物防治

1．4．3 拮抗酵母菌在生物降解OTA中的研究进展

1．5 本课题研究的目的及意义

第二章 OTA产生菌的筛选与鉴定

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 菌种来源

2．2．4 培养基

2．2．5 产OTA菌株的分离纯化

2．2．6 OTA产生菌株的筛选

2．2．7 分子生物学鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 紫外荧光法筛选OTA产生菌

2．3．2 HPLC-FLD法验证OTA产生菌

2．3．3 产毒菌株5．8S rDNA-ITS区序列的测定与分析

2．4 讨论

第三章 产毒素菌株的生长及产毒素能力研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 菌种来源

3．2．4 培养基

3．2．5 菌悬液的制备

3．2．6 产毒素菌株的生长条件研究

3．2．7 产毒素菌株的产毒能力研究

3．3 结果与分析

3．3．1 产毒素菌株的生长条件研究

3．3．2 产毒素菌株的产毒能力研究

3．4 讨论

第四章 耶罗维亚酵母对葡萄采后病害抑菌效果研究

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 主要仪器

4．2．2 水果

4．2．3 拮抗酵母

4．2．4 病原菌

4．2．5 Y．lipolytica对葡萄采后P．islandicum O-1致病性的影响

4．2．6 Y．lipolytica对葡萄采后青霉病的抑制效果

4．2．7 Y．lipolytica在葡萄伤口处的生长繁殖

4．2．8 Y．lipolytica对葡萄自然腐烂和贮藏品质的影响

4．2．9 数据统计与分析

4．3 结果与分析

4．3．1 Y．lipolytica对葡萄采后P．islandicum O-1的体外抑制作用

4．3．2 Y．lipolytica对葡萄采后P．islandicum O-1的抑制效果

4．3．3 Y．lipolytica在葡萄伤口处的生长繁殖曲线

4．3．4 Y．lipolytica对葡萄自然腐烂及贮藏品质的影响

4．4 讨论

第五章 Y．lipolytica抑制P．islandicum生长和产毒素能力的蛋白质组学研究

5．1 引言

5．2 材料和方法

5．2．1 主要仪器及化学试剂

5．2．3 酵母与霉菌混合培养

5．2．4 酵母菌对OTA的降解作用研究

5．2．5 总蛋白的提取

5．2．6 双向电泳

5．2．7 凝胶图谱分析

5．2．8 质谱实验操作流程

5．2．9 蛋白鉴定

5．3 结果与分析

5．3．1 Y．lipolytica对OTA的降解效果实验

5．3．2 蛋白质双向电泳图

5．3．3 蛋白差异点质谱鉴定结果

5．4 讨论

第六章 结论与展望

6．1 主要结论

6．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文及申请专利