精神分裂症中microRNA-7异常表达及其与靶基因的相互作用研究

摘要

目的：验证精神分裂症患者与正常对照之间血浆microRNA-7（miR-7）的表达是否存在差异。以小鼠海马神经元细胞株HT22为实验对象，研究mR-7与SHANK3等靶基因之间相互作用关系，探索mR-7对神经元形态及功能的影响。
　　方法：qRT-PCR技术检测正常人(n=50)和精神分裂症患者(n=50)血浆miR-7的表达。采用在线软件预测mR-7的靶基因，选择与神经元生长发育、信号传导及突触可塑性相关的基因进行下游实验。构建miR-7干扰及过表达病毒，感染小鼠海马神经元细胞株HT22，qRT-PCR验证其干扰效率同时检测靶基因GRIN2A，ERBB4，GADE，GABRA6和SHANK3的表达，免疫荧光检测SHANK3蛋白表达差异。将SHANK33'-UTR端插入荧光素酶报告基因载体中，将microRNA-7 shRNA和minics分别与SHANK3共转，检测荧光素酶报告基因活性。
　　结果：1、与正常人比较，精神分裂症患者血浆miR-7水平显著升高(p=0.022)。2、细胞水平的研究结果显示过表达miR-7可显著抑制SHANK3的表达，且miR-7被抑制后SHANK3的表达量显著增高。Luciferase实验结果表明miR-7与SHANK3的3'-UTR区直接结合，进而发挥调节作用。3、除了直接通过结合SHANK3基因3'-UTR区调控其表达外，miR-7的表达量改变还可以影响ERBB4、GAD1和GABRA6 mRNA水平。4、与另外四个基因不同，miR-7对基因GRIN2A的调控表现为促进作用，结果显示GRIN2A基因mRNA水平随miR-7的过表达而增高，而miR-7被抑制后，GRIN2A的表达也随之降低。
　　结论：精神分裂症患者血浆miR-7的表达高于正常人，异常表达的miR-7可能通过调控SHANK3等基因的表达而影响到神经元正常的形态和功能，进而在精神分裂症的病理机制中起到了一定作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 溶液配制

2．2 实验方法与流程

2．2．1 临床病例纳入标准

2．2．2 海马神经元复苏与传代

2．2．3 海马神经元鉴定

2．2．4 miR-7和anta-miR-7载体构建

2．2．5 Shank3载体构建

2．2．6 质粒小抽

2．2．7 琼脂糖凝胶电泳回收

2．2．8 细胞转染

2．2．9 荧光素酶报告基因检测

2．2．10 病毒包装

2．2．11 Real-time PCR实验

2．2．12 统计学分析

第三章 结果

3．1 精神分裂症患者与正常人血浆miR-7表达

3．2 小鼠海马神经元免疫荧光鉴定图片

3．3 载体构建测序实验报告

3．4 病毒滴度测定

3．4．1 miR-7过表达病毒滴度测定

3．3．2 miR-7干扰病毒滴度测定

3．5 miR-7与其预测基因间相互作用

3．6 miR-7与SHANK3相互作用

3．7 miR-7与SHANK3 3′-UTR结合活性检测

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

附录

攻读硕士学位期间公开发表的论文及参加的项目

致谢