灵芝与薏苡仁多糖在口服薏苡仁组分微乳构建中的作用及机制探讨

摘要

中药植物多糖是从中药中提取获得的有一定亲水性的大分子聚合物，具有明显的两亲性和独特的药理活性。现代药理学研究发现其能够参与机体的生理代谢过程，具有增强免疫、抗肿瘤、降血糖等生物活性。同时，其复杂的化学结构与链构象使得其具有水溶性好、生物粘附强、分子柔性与强度好等优点，可以应用于药剂学领域。然而，目前对中药植物多糖的研究大多只关注其药理活性，其独特的理化性质目前尚未被药剂学领域充分关注。课题组前期研究发现，以灵芝多糖与薏苡仁多糖作为功能性辅料参与构建微乳载药系统，可以增强微乳增溶能力，发挥协同抗肿瘤作用。结合文献报道，中药植物多糖作为一种大分子聚合物，存在与药物晶体氢键缔合，产生流体界面层，抑制晶体生长;占据制剂表面吸附部位并形成空间位阻，从而提高制剂的稳定性;对制剂进行网格包裹，抑制沉淀等可能性。因此，本文以灵芝多糖与薏苡仁多糖为研究对象，考察了其对薏苡仁油微乳载药系统构建的药剂与药效作用，探讨了多糖与微乳间的作用机制，为探索中药植物多糖对微乳等新型载药系统构建的作用，拓宽中药植物多糖的药剂学应用提供研究基础，主要研究内容如下:
　　1.有效组分的提取与纯化
　　构建微乳脂质内核的薏苡仁油通过超临界CO2萃取技术获得，薏苡仁油的含量为40.83 mg·g-1生药，HPLC法测得甘油三油酸酯含量为10.15 mg·g-1生药，分光光度法测得总甘油三酯的含量为35.39 mg·g-1生药，薏苡仁油的纯度为86.67％（以总甘油三酯计）。
　　采用水提-初级醇沉-精制醇沉-透析法提取并纯化了灵芝多糖，经参数优选，获得灵芝多糖水提最佳条件为:料液比1∶10，提取次数为3次，每次提取时间为2h;初级醇沉最佳条件为:水提浓缩液浓度2.0 g·mL-1，醇沉浓度为80％，醇沉时间24 h，醇沉温度25℃;精制醇沉最佳醇沉浓度为80％;采用截留分子量3000的透析袋透析去除小分子杂质，冷冻干燥后得灵芝多糖粉末，分光光度法测得灵芝多糖纯度为60.13％（以葡萄糖计）。
　　采用水提-去淀粉-醇沉-去蛋白法提取并纯化薏苡仁多糖，对其参数进行优选。获得薏苡仁多糖水提最佳条件为:料液比1∶12，提取次数为3次，每次提取时间为2h;醇沉最佳条件为:水提浓缩液浓度1.0 g·mL-1，醇沉浓度80％，醇沉时间12h，醇沉温度25℃;采用Sevag试剂去除蛋白质，冷冻干燥后得薏苡仁多糖粉末，分光光度法测得薏苡仁多糖纯度为76.63％（以葡萄糖计）。
　　2.灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳处方筛选与表征
　　以薏苡仁油为油相，结合伪三元相图，水滴定法制备微乳并以微乳区面积为指标，筛选并确定了最佳乳化剂为RH40，助乳化剂为PEG400，Km值为3∶1。固定薏苡仁油用量为400 mg，以微乳粒径与澄明度为指标，确定了乳化剂用量最低为200 mg，PEG400最低用量为67 mg。分别添加灵芝与薏苡仁多糖至薏苡仁油微乳中，考察两种多糖的乳化剂替代作用，确定灵芝与薏苡仁多糖替代乳化剂RH40最大量为50 mg，最终处方为:薏苡仁油400 mg，RH40150 mg，灵芝或薏苡仁多糖50 mg，PEG40067 mg。按上述处方制备灵芝多糖荷载微乳与薏苡仁多糖荷载微乳，所得微乳均为澄明溶液，粒径分别为87.94±3.17与86.07±1.41 nm，PDI分别为0.092±0.033与0.095±0.010，Zeta电位分别为-(12.10±0.70)与-(8.34±0.05) mV。
　　3.灵芝与薏苡仁多糖对微乳理化性质的影响
　　考察了灵芝与薏苡仁多糖的加入对薏苡仁油微乳粒径、电位、形态及相转变温度的影响。灵芝与薏苡仁多糖的加入不改变微乳粒径与形态，微乳的相转变温度无明显变化，但微乳表面负电荷被掩盖，表面电位升高。稳定性实验发现微乳本身具有较强的稳定性，稀释、离心、变温与冻干复溶下均能维持微乳结构而无分层与絮凝现象出现，灵芝与薏苡仁多糖加入后的微乳仍具有该性质。
　　混合制备（多糖与乳化剂、助乳化剂、薏苡仁油混匀后，纯化水滴定制备微乳）与滴注共载（乳化剂、助乳化剂、薏苡仁油混匀后，多糖水溶液滴定制备微乳）两种多糖荷载微乳的制备方法所得微乳的粒径、电位与相转变温度无显著性差异，微乳的形态一致，且均具有较强的稳定性，稀释、离心、变温与冻干复溶后粒径无显著性差异，提示这两种制备方法对多糖荷载微乳的制备无显著性差异。
　　4.灵芝与薏苡仁多糖对微乳作用机制研究
　　动态光散射技术发现，随着灵芝多糖与薏苡仁多糖的浓度提高，微乳表面电位逐渐升高直至维持恒定，提示灵芝多糖、薏苡仁多糖能够包裹在微乳表面从而掩盖其表面电荷。
　　为了阐述多糖与微乳间作用机制，采用壳聚糖与葡聚糖这两种不同单体多糖模拟灵芝多糖与薏苡仁多糖进行本课题研究，其中葡聚糖对微乳表面电位作用与灵芝多糖以及薏苡仁多糖一致。通过化学方法合成了FITC标记的壳聚糖(CSF)与葡聚糖(DTF)，红外图谱与核磁氢谱表明壳聚糖与葡聚糖均成功被FITC修饰，其FITC取代度分别为6.25％与7.02％。
　　凝胶渗透实验发现，CSF荷载微乳与DTF荷载微乳经凝胶柱筛分后，多糖荷载微乳出峰时间提前并且吸光度提高，同时CSF与DTF吸光度降低，提示壳聚糖与葡聚糖及其所模拟的中药植物多糖可以结合至微乳体系。
　　荧光能量转移实验发现，FITC标记的壳聚糖以及葡聚糖能够与薏苡仁油微乳脂核内的罗丹明123(Rh123)产生荧光能量共振现象，而FITC标记的壳聚糖以及葡聚糖与Rh123于溶液中共存无荧光能量共振现象发生，壳聚糖以及葡聚糖与微乳脂核之间的距离小于10nm，利用公式计算得葡聚糖与微乳腊核间距离为1.70 nm。提示灵芝与薏苡仁多糖可能以部分链内嵌至微乳内核的方式与微乳相互作用并掩盖其电荷。
　　5.灵芝与薏苡仁多糖对微乳药效学影响
　　以A549肺癌细胞为模型考察了灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳的体外抗肺癌药效，薏苡仁油微乳IC50为127μg·mL-1，灵芝多糖荷载微乳为119μg·mL-1，薏苡仁多糖荷载微乳为104μg·mL-1，与薏苡仁油微乳相比，灵芝与薏苡仁多糖的加入降低了IC50，提高了体外抗肺癌药效。以Caco-2为细胞模型的肠道毒性实验发现，与薏苡仁油微乳相比，Caco-2细胞孵育后，灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳的细胞毒性小于薏苡仁油微乳。体内抗肿瘤实验表明，与生理盐水组相比，多糖荷载微乳组肿瘤重量与肿瘤体积显著降低，灵芝多糖荷载微乳的抑瘤率为52.06％，薏苡仁多糖荷载微乳的抑瘤率为44.13％，灵芝多糖荷载微乳的抗肺癌药效与已上市康莱特注射液(58.75％)相当。组织分布实验表明，灵芝与薏苡仁多糖对微乳体内肠道滞留性有明显提高，给药后肿瘤部位明显蓄积。
　　本研究以灵芝多糖与薏苡仁多糖为研究对象探求了中药植物多糖与现代新型载药系统微乳之间的作用及其机制，提出了灵芝多糖与薏苡仁多糖可能通过部分嵌入部分包裹的方式与微乳结合，从而降低辅料用量，维持微乳结构稳定，提高微乳瘤内分布、增强微乳抗肺癌药效。本课题为拓展中药多糖在新剂型中的应用提供前期探索，也为中药多组分共传递系统的研究提供新的研究方向与研究基础。

目录

声明

摘要

注释表

第一章 绪论

1．1 中药微乳载药系统的研究进展

1．2 多糖在纳米载药系统中应用的研究进展

1．3 本课题的研究目的与意义

第二章 有效组分的提取与纯化

2．1 薏苡仁油的提取

2．2 灵芝总多糖的提取与纯化

2．3 薏苡仁总多糖的提取与纯化

2．4 本章小结

第三章 灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳的处方筛选与表征

3．1 灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳的处方筛选

3．2 灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳的表征

3．3 本章小结

第四章 灵芝与薏苡仁多糖对微乳理化性质与稳定性的影响

4．1 灵芝与薏苡仁多糖对微乳理化性质的影响

4．2 灵芝与薏苡仁多糖对微乳稳定性的影响

4．3 本章小结

第五章 灵芝与薏苡仁多糖对微乳载药系统作用机制研究

5．1 动态光散射技术研究多糖包裹作用机制

5．2 凝胶渗透实验研究多糖吸附作用机制

5．3 荧光能量共振转移技术研究多糖内嵌作用机制

5．4 分子间距离测定研究多糖与微乳作用机制

5．5 本章小结

第六章 灵芝与薏苡仁多糖对微乳抗肺癌药效作用研究

6．1 灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳对A549细胞生长的影响

6．2 灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳对Caco-2细胞生长的影响

6．3 灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳体内抗肿瘤作用考察

6．4 灵芝与薏苡仁多糖荷载微乳体内组织分布研究

6．5 本章小结

第七章 总结

7．1 全文结论

7．2 创新点

7．3 工作展望

参考文献

致谢

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