n-乙基-1’-氧代靛玉红的抗肿瘤活性及其可能机制

摘要

目的:检测新合成的一种靛玉红衍生物，N-乙基-1'-氧代靛玉红(N-Ethyl-1'-oxindirubin，E-1'-OI)在体抑瘤效果、离体肿瘤细胞毒性及其可能的作用机制。
　　方法:用MTT实验测定E-1'-OI对不同肿瘤细胞(HeLa、HCT116和HepG2)的毒性，并计算半数抑制率(IC50)。用HepS移植瘤模型测定E-1'-OI的在体抗肿瘤活性。对肿瘤组织进行TUNEL染色，用western blot检测了肿瘤组织中PARP、caspase-3、PCNA(proliferating cell nuclear antigen)和p-STAT3(phospho-transcription factor signal transducer and activator of transcription3)蛋白的表达，免疫组化分析肿瘤组织中PCNA和p-STAT3的表达，以研究E-1'-OI抑制HepS移植瘤生长的机制。对荷瘤小鼠的体重及其免疫器官指数进行测定，分析E-1'-OI的毒性作用。用HepG2细胞进行E-1'-OI的机制研究。用PI染色法测定细胞周期，AnnexinⅤ/PI双染色法测定细胞凋亡，JC-1染色法测定细胞线粒体膜电位，Western blot测定线粒体介导细胞凋亡通路中相关蛋白细胞色素C、PARP、caspase-3、caspase-7、caspase-9、Bcl-2和Bax的表达，DCFH-DA荧光探针测定细胞内ROS的水平。
　　结果:首先发现E-1'-OI对HeLa、HCT116和HepG2细胞均呈现较为明显的增殖抑制作用。其中，HepG2细胞对于E-1'-OI反应更为敏感。细胞形态学的观察结果可以发现，E-1'-OI可以时间浓度依赖性地抑制HepG2细胞的增殖。其次，E-1'-OI(40 mg/kg)不仅能够抑制HepS移植瘤体积的增大，而且能够减轻肿瘤重量，对HepS移植瘤的抑制率为59.40％，其抗肿瘤效应接近阳性对照药5-FU(抑制率为56.55％)，明显高于靛玉红(40 mg/kg)（抑制率仅为5.60％）。除此之外，TUNEL分析实验的结果表明，E-1'-OI能够诱导HepS移植瘤细胞发生凋亡。在HepS移植瘤中，E-1'-OI通过诱导PARP蛋白出现裂解，降低caspase-3前体蛋白procaspase-3的水平发挥其在体诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡的作用。再者，在western blot实验结果中发现，与对照组和靛玉红处理组(40 mg/kg)相比，E-1'-OI处理组的PCNA和p-STAT3蛋白表达水平呈浓度依赖性降低。这一实验结果与免疫组化分析的结果一致，均表明E-1'-OI可以抑制肿瘤细胞的增殖。E-1'-OI不仅对荷瘤小鼠的体重未产生明显影响，而且未显示出明显的免疫抑制毒性。在培养的HepG2细胞上还观察到E-1'-OI和阳性对照药紫杉醇一样均可诱导HepG2细胞出现G2/M阻滞。在10、20和40μM E-1'-OI作用下，HepG2细胞早期凋亡率由3.1％分别上升至7.0％、33.6％和82.5％。随着E-1'-OI给药浓度的增加，细胞的早期凋亡率呈上升趋势。在E-1'-OI诱导HepG2细胞发生细胞凋亡这一过程中，同时还出现了HepG2细胞线粒体膜电位的降低和细胞色素C由线粒体释放至胞浆的现象。随着E-1'-OI给药浓度的增高，除了PARP蛋白出现裂解，线粒体介导的细胞凋亡通路中的凋亡执行蛋白——caspase-9、caspase-7、caspase-3均裂解为活性片段。再者，用E-1'-OI处理细胞24 h后发现，随着给药浓度的增高，促凋亡蛋白Bax的表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低。还发现E-1'-OI会诱导HepG2细胞内活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)水平上升。但是，当用ROS清除剂NAC(N-acetyl cysteine)作用于给药细胞后，可部分逆转40μM E-1'-OI所引起的细胞增殖抑制和线粒体膜电位降低。除此之外，NAC能够部分降低由40μM E-1'-OI所诱导的PARP的裂解和Bax的蛋白表达，可以逆转procaspase-9、procaspase-7、procaspase-3和Bcl-2蛋白表达水平的降低。
　　结论:实验结果表明E-1'-OI具有良好的抗肿瘤作用。它能够诱导肿瘤细胞发生细胞周期阻滞和线粒体依赖性的细胞凋亡。而且E-1'-OI所介导的细胞凋亡与氧化应激密切相关。此研究结果为继续深入研究E-1'-OI——这一具有良好抗肿瘤效果的药物提供了实验依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 天然药物的抗肿瘤活性

1．2 靛玉红的来源

1．3 靛玉红的抗肿瘤作用

1．4 靛玉红的抗肿瘤作用机理

1．4．1 抑制肿瘤细胞的增殖

1．4．2 诱导肿瘤细胞发生凋亡

1．4．3 抑制肿瘤转移

1．5 靛玉红的作用靶点

1．5．1 细胞周期依赖性蛋白激酶(CDKs)

1．5．2 糖原合成酶激酶-3(GSK-3)

1．5．3 信号转导和转录激活因子(STAT)

1．6 本课题的研究思路

第二章 E-1’-OI抑制肿瘤细胞的增殖

2．1 实验材料

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器

2．1．3 细胞株

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞增殖实验(MTT实验)和IC50测定

2．3 实验结果

2．3．1 E-1’-OI抑制不同肿瘤细胞的增殖

2．3．2 E-1’-OI抑制不同细胞增殖的IC50值

2．4 本章小结

第三章 E-1’-OI在体抑制HepS移植瘤的生长

3．1 实验材料

3．1．1 试剂

3．1．2 化合物的配制

3．1．3 仪器

3．1．4 细胞株

3．1．5 实验动物

3．2 实验方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 小鼠HepS移植瘤模型的建立

3．2．3 分组设计

3．2．4 肿瘤的体积及生长抑制率的测定

3．2．5 病理切片的观察及评分

3．2．6 TUNEL分析肿瘤细胞凋亡

3．2．7 肿瘤组织蛋白的提取

3．2．8 Western blot分析蛋白表达

3．2．9 免疫组织化学分析PCNA和p-STAT3的表达

3．2．10 荷瘤小鼠的体重及脏器指数的测定

3．2．11 统计学方法

3．3 实验结果

3．3．1 E-1’-OI能够在体抑制HepS移植瘤的生长

3．3．2 E-1’-OI对HepS移植瘤治疗效果的病理学观察

3．3．3 E-1’-OI抑制HepS移植瘤细胞增殖诱导其发生凋亡

3．3．4 E-1’-OI对荷瘤小鼠的体重及其免疫器官的影响

3．4 本章小结

第四章 E-1’-OI诱导HepG2细胞死亡的机制

4．1 实验材料

4．1．1 试剂

4．1．2 仪器

4．1．3 细胞株

4．2 实验方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 PI染色流式细胞术测定细胞周期

4．2．3 Annexin V／PI双染色法流式细胞术测定细胞凋亡

4．2．4 JC-1染色法测定线粒体膜电位

4．2．5 细胞线粒体分离

4．2．6 细胞全蛋白的提取

4．2．7 Western blot分析蛋白表达

4．2．8 DCFH-DA荧光探针测定细胞内ROS的生成

4．2．9 细胞增殖实验(MTT实验)

4．2．10 统计学方法

4．3 实验结果

4．3．1 E-1’-OI可以诱导HepG2细胞发生细胞周期阻滞

4．3．2 E-1’-OI可以诱导HepG2细胞发生细胞凋亡

4．3．3 E-1’-OI通过介导线粒体通路诱导HepG2细胞发生细胞凋亡

4．3．4 ROS在E-1’-OI介导的HepG2细胞死亡的过程中起着重要的作用

4．4 本章小结

第五章 讨论

结论与展望

参考文献

致谢

在校期间发表的文章