Synechocystis PCC 6803细胞中双元系统组分及毒素-抗毒素系统组分与其他蛋白之间的相互作用

摘要

双元系统(two-component signaling system，TCS)和 II型毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system，TAS）是细菌适应特异性环境胁迫的重要调控系统，广泛存在于各种细菌中。典型的TCS是由组氨酸激酶（histidine kinase，HK）和反应调控因子（response regulator，RR）组成。当HK感应到特异性的环境胁迫时，其保守的组氨酸残基磷酸化，并将磷酸基团传递到下游的反应调控因子保守的天冬氨酸残基。激活的反应调控因子调控与细胞适应特异环境胁迫相关的基因表达，表达产物通过调控细胞的代谢使细菌适应特异性环境胁迫。II型TA系统通常由稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素蛋白构成。毒素通过作用于细胞重要的过程而调控细胞的生长，使细菌适应特异的环境胁迫。毒素的活性是由抗毒素在转录水平和蛋白水平上的调控决定的。具有独特环境适应能力并由此获得生态竞争优势的蓝藻中存在大量TCS和TAS。模式蓝藻Synechocystis PCC6803染色体上有44个组氨酸激酶基因、42个反应调控因子基因以及至少34个属5个家族的TAS。除部分TCS的构成和生理功能被阐明外，多数TCS的组成及功能还不清楚。并且，Synechocystis PCC6803中一些TAS具有非典型的活性调控模式，推测可能存在其他非TAS蛋白参与其活性调控。
　　蛋白质间的相互作用是细胞完成信号转导、蛋白活性调控和复合体形成的重要过程。为阐明Synechocystis PCC6803中TCS组分构成、TAS活性的调控，本文根据组学水平上蛋白相互作用的分析结果，研究TCS组分之间以及TAS组分与其他蛋白之间的相互作用。本文主要内容包括：
　　（1）酵母双杂交系统表达质粒的构建。PCR扩增可能存在相互作用的13对TCS组分、13个TAS组分与15个非TAS组分的基因。将扩增产物克隆于酵母双杂交系统的表达质粒中，构建相应的酵母表达重组质粒。
　　（2）利用酵母双杂交技术分析TCS组分之间及TAS组分与其他蛋白之间的相互作用。将构建的酵母双杂交系统表达质粒共转化酵母细胞，构建酵母双杂交的重组菌株。根据重组菌株在不同的选择性培养基中的表型特征，确定TCS组分之间，以及TAS毒素或抗毒素与其他细胞蛋白之间的相互作用。
　　（3）相互作用的TCS组分基因缺失突变株的构建与表型分析。根据酵母双杂交技术的试验结果，选择一对相互作用的TCS组分，通过基因敲出构建相应的缺失突变株，分析缺失突变株在胁迫条件下的生长表型。根据突变株生长表型的一致性进一步确定TCS组分之间的相互作用。
　　研究得到以下结论：
　　（1）TCS组分Hik10与Rre3，Hik13与Rre18，Hik38与Hik28，Hik16与Rre17，Hik5与Rre42，Hik7与Rre5之间存在相互作用;此外8个TAS组分与10个已知或未知功能非TAS组分之间存在相互作用;VapBC10与VapBC12系统组分之间存在交互作用。
　　（2）Rre3缺失突变株与Hik10缺失突变株在高盐和Cd2+胁迫条件下的生长表型分析显示，在高盐条件下Rre3缺失突变株与Hik10缺失突变株的生长状态与野生型表型无显著性差异；在Cd2+胁迫条件下，两突变株具有相同的生长表型，且生长速度显著低于野生型藻株。结果提示，组氨酸激酶Hik10和反应调控因子Rre3可能构成一个具有功能的TCS系统，并介导Synechocystis细胞适应Cd胁迫。

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第一章 文献综述

1.1 双元系统

1.2 毒素-抗毒素系统

1.3 酵母双杂交技术验证蛋白的相互作用

1.4 本实验的研究目的和意义

第二章 材料和方法

2.1 分子生物学试剂和菌株

2.2 培养条件和方法

2.3 分子生物学操作方法

2.4 缺失突变株的构建

第三章 结果和讨论

3.1 可能相互作用的蛋白基因的克隆

3.2 酵母表达相互作用的蛋白基因的重组质粒构建

3.2 表达质粒转化及共转化子筛选

3.3 阳性酵母共转化子的鉴定

3.4 突变株DR1552和DR1554胁迫条件下生长特性分析

3.5 讨论

第四章 总结与展望

4.1 总结

4.2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

附 表 1 基因克隆于pMD-18T中的质粒

附 录 A 缩略语

附 录 B 主要实验仪器

附 录 C 主要试剂及配制