发酵环境影响灰树花菌丝体生长和多糖合成的研究

摘要

在液态培养过程中，发酵环境显著影响食药用真菌的菌丝体生长、形态及代谢产物合成等，同时食药用真菌菌丝体形态可能影响活性多糖结构，继而导致其生物活性差异。灰树花（Grifola frondosa）作为一种广受欢迎的食药用真菌，其多糖具有抗肿瘤、增强免疫力和降血糖等活性。过去诸多研究多集中在灰树花菌丝体和胞外（内）多糖最大产量（率）为目标的液体培养条件优化和多糖/多糖复合物结构解析和活性评价，而对于培养条件对食药用真菌液体发酵过程中菌丝体形态的影响，菌丝体形态对功能性多糖/多糖复合物合成过程中的作用等关键问题知之甚少。因此，在本课题组前期研究的基础上，本文从发酵环境调控的角度，研究了不同搅拌、通气量和添加无机微粒子等发酵环境因子对灰树花菌丝体生长及多糖合成的影响，主要研究结果如下：
　　(1)在20L发酵罐规模条件下，考察了搅拌转速和通气量对灰树花GF9801菌体形态和胞外多糖产量等的影响。结果表明，在通气量为0.50 vvm，搅拌转速为90 rpm条件下，发酵醪中菌球占52.23％；生物量与菌丝体多糖产量达到最高值，分别为22.49 g/L和0.12 g/g。搅拌转速120 rpm有利于胞外多糖的合成，其产量、生产强度分别为2.19 g/L、0.31 g/L·d，此时光滑菌球占主要部分，游离菌丝体和菌团各占20%左右。通气量1.0 vvm促进灰树花菌体的生长，生物量达到24.75 g/L，菌团比例最大。0.75 vvm对多糖的合成有一定的促进作用，胞外多糖及菌丝体多糖产量均达到最高，分别为2.32 g/L，0.32 g/g。说明中等的搅拌与通气量促进灰树花的生长，球状形态有利于其多糖的合成。
　　(2)考察了在灰树花GF9801摇瓶培养过程中分别添加0~20 g/L的Al2O3(48~75μm)和Talc(45μm)对灰树花菌体生长性能的影响。结果表明，Al2O3的添加能减小菌球的直径，S型菌体的比例随着添加浓度的升高而增加，最高为70.83%；3 g/L时生物量最大值为20.33 g/L，10 g/L与6 g/L分别达到胞外多糖及菌丝体多糖的最大值，为3.38 g/L和0.26 g/g。添加滑石粉后，菌球体积减小，且20 g/L时S型菌体比例最高达到75.41%；适宜浓度的滑石粉对灰树花的生物量和胞内外多糖产量有促进作用，6 g/L时生物量最高为19.25 g/L，胞外多糖产量也最高，为3.12 g/L；3 g/L时达到菌丝体多糖产量最大值，为0.24 g/g。本实验中添加氧化铝的效果优于滑石粉。
　　(3)研究了不同发酵环境对灰树花多糖中单糖组成的影响。在不同搅拌、通气量的培养下，灰树花胞外多糖主要由葡萄糖组成，其含量均超过95%，并含有少量的阿拉伯糖和甘露糖。菌丝体多糖中葡萄糖与甘露糖占主要部分，阿拉伯糖相比胞外多糖中含量增加，并出现了少量的半乳糖。60 rpm下甘露糖含量最高为51.05%，阿拉伯糖比例最大值在0.75 vvm时达到，为14.02%。结果表明，搅拌和通气量对胞外多糖的组成影响不大，但对菌丝体多糖的单糖组成及比例有显著影响。
　　分别添加0~20 g/L的氧化铝与滑石粉后，灰树花胞外多糖中葡萄糖含量相比对照组均下降，且当两种微粒子的添加量为6g/L时，胞外多糖中葡萄糖含量最低，滑石粉中仅为77.96%。添加一定浓度的微粒子促进了半乳糖的合成，其中，添加6 g/L的滑石粉时半乳糖比例达到16.77%。随着微粒子浓度的增加，菌丝体多糖中葡萄糖下降，添加20 g/L的氧化铝，葡萄糖含量最小仅为12.70%；而半乳糖含量升高，20 g/L的滑石粉中最高可达31.19%；阿拉伯糖的含量均高于对照组。
　　(4)分析了发酵环境对灰树花多糖合成中相关酶的比酶活的影响。结果表明，灰树花多糖中葡萄糖、甘露糖、半乳糖的比例与其相关酶活的变化在不同的发酵环境中呈现了相似的变化规律。当60 rpm甘露糖含量最高时，GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPPB)比酶活同组最高可达82 mU/mg；添加20 g/L的氧化铝后，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPG)比酶活最低为68 mU/mg；UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(UGE)的最大比酶活在添加20 g/L的滑石粉时达到，为165 mU/mg。磷酸葡萄糖异构酶(PGI)和GMPPB对甘露糖含量有重要的影响，UGPG与UGE分别对葡萄糖和半乳糖含量有重要的影响。

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缩略词表

第一章 绪论

1.1 食用真菌

1.2 液体发酵中的菌体形态

1.3 灰树花多糖概述

1.4 微生物多糖的生物合成

1.5 本课题的研究背景及研究内容

第二章 搅拌转速和通气量对灰树花菌体生长及多糖产量的影响

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 无机微粒子对灰树花菌体生长及多糖产量的影响

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.3 试验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章 不同发酵环境下灰树花多糖组成及相关酶活的变化

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.3 实验方法

4.4结果与讨论

4.5 本章小结

第五章 全文总结及展望

5.1 全文主要结论

5.2 存在问题及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文及其他科研成果