天然活性成分强心甾类固醇的靶向前体药物的研究

摘要

强心甾类固醇（cardiotonic steroids，CTS）是一类具有强心作用的甾体类化合物，一般分为两类：五元内酯环强心苷类（如洋地黄苷、毛地黄强心苷、G-毒毛旋花子苷）和六元内酯环强心苷类（如蟾蜍甾类、海葱类）。近年来，强心甾类固醇在抑制恶性肿瘤细胞生长和诱导癌细胞凋亡方面显示出巨大潜力，其在临床上预防和治疗癌症效果方面也倍受期待。强心苷药物地高辛、毒毛花苷G和半合成药物UNBS1450等已投入到临床肿瘤治疗研究中，然而疗效却远远未达预期。将强心甾类固醇物质应用于临床肿瘤治疗还需解决很多问题，如心脏毒性大、临床治疗窗窄、药物递送率低以及肿瘤组织靶向性差等。因此，强心甾类固醇应用于临床肿瘤治疗依然有很长的路。目前，研究趋向于开发无心脏毒性而抗肿瘤活性增强的先导化合物。本文从香加皮和北葶苈子中筛选得到六种强心甾类固醇成分，体外抑瘤实验证实六种强心甾类固醇成分具有良好的抗肿瘤效果。以提取得率、前药合成工艺难易程度为考虑指标，选择从香加皮提取得到的杠柳苷元（强心甾类固醇糖配体成分）和杠柳次苷（强心苷类成分）为研究对象，合成高效低毒的靶向前体药物和靶向纳米前药，并对靶向偶联物前药和纳米前药进行了体内外评价，为强心甾类固醇临床肿瘤治疗提供新方法和新思路。
　　第一章强心甾类固醇的抗肿瘤研究及前体设计在提高肿瘤靶向性和活性中的应用研究进展
　　本章对天然活性成分强心甾类固醇的抗肿瘤机理及前体药物设计的研究现状进行了综述。同时，阐述了本文研究对象，即杠柳苷元和杠柳次苷的研究现状。针对杠柳苷元和杠柳次苷应用面临的问题，本论文提出了解决方案，确立了立题依据和设计思路与构想，为本论文实验工作的顺利开展奠定了良好的理论基础。
　　第二章天然产物抗肿瘤活性成分的筛选及其结构分析
　　本章选择天然产物北葶苈子和香加皮为主要研究对象，通过活性追踪法从香加皮和北葶苈子中筛选分离得到六种具有细胞毒性的化合物，采用核磁共振氢谱、碳谱及二维图谱、质谱和红外图谱进行了结构分析。考察了六种活性成分的体外抗肿瘤活性。
　　1、天然产物抗肿瘤活性成分的筛选：以水提取北葶苈子后浓缩成浸膏，乙醇沉淀蛋白，用乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，各部位各部位进行体外抗肿瘤活性评价，结果显示，二氯甲烷和正丁醇部位具有良好的体外抗肿瘤活性。采用正反相硅胶柱层析法分离纯化活性部位，从二氯甲烷部位筛选得到活性成分1，得率为0.0013％，从正丁醇部位筛选得到活性成分2和3，得率分别为0.00071%和0.000043%。以同样的筛选方法，从香加皮正丁醇部位中分离纯化得到化合物4，得率为0.038%。化合物4经过酸水解和酶水解分别得到化合物5和6，得率分别是0.0153%和0.02295%，均显著高于北葶苈子化合物1-3的提取得率。
　　2、活性成分的结构鉴定及抗肿瘤活性比较：经核磁共振氢谱、碳谱及二维图谱、质谱和红外图谱对活性成分进行了结构鉴定，化合物1-3经鉴定分别为葶苈苷、伊芙苷和伊芙双苷，均为首次从北葶苈子中筛选得到的化合物。从香加皮中筛选得到的化合物4-6，经鉴定分别是杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷。该六种化合物均为强心甾类固醇成分。MTT法考察了单体成分的体外抗肿瘤活性，体外细胞毒性结果显示，杠柳次苷的抗肿瘤活性最强（对MCF-7的IC50为0.019±0.012μg/mL），构效关系表明，强心苷结构中糖的数目和种类对活性有一定的影响。同时强心甾类固醇成分对肿瘤细胞的毒性明显强于5-Fu，而对正常细胞的毒性小于5-Fu。
　　第三章奥曲肽偶联杠柳苷元靶向治疗肝癌的实验研究
　　奥曲肽（OCT）被临床应用于治疗和诊断SSTRs高表达恶性肿瘤，随着其在肿瘤造影中的成功利用，亦被用于药物肿瘤传递系统中。本章采用直接酸水解香加皮正丁醇部位分离纯化得到杠柳苷元（PPG），其得率显著提高，为0.048%。以杠柳苷元为研究对象，合成了奥曲肽-杠柳苷元（OCT-PPG）的偶联物，并对各种偶联物进行细胞毒性研究。建立了杠柳苷元在小鼠血浆、脏器和实体瘤组织中的检测方法。考察了杠柳苷元和奥曲肽-杠柳苷元偶联物在小鼠体内组织分布特性。建立了小鼠移植性肝癌（H22）实体瘤模型。评价了奥曲肽-杠柳苷元偶联物的体内抑瘤效果及其心脏和肝脏毒性。
　　1、奥曲肽-杠柳苷元偶联物的合成及其体外细胞毒性的评价：采用酸水解法制备杠柳苷元。经红外光谱、质谱和核磁共振氢谱鉴定，结果表明，成功制备了杠柳苷元。以丁二酸酐为连接剂，合成得到奥曲肽-杠柳苷元偶联物，分别为奥曲肽（苯丙氨酸）-杠柳苷元偶联物OCT(Phe)-S-PPG、奥曲肽（赖氨酸）-杠柳苷元偶联物OCT(Lys)-S-PPG和杠柳苷元-奥曲肽-杠柳苷元偶联物OCT-2S-2PPG。通过LC-MS、红外、质谱、核磁共振氢谱对上述三种反应产物进行表征。采用MTT法测定OCT(Phe)-S-PPG、OCT(Lys)-S-PPG和OCT-2S-2PPG的细胞毒性，结果显示，OCT(Phe)-S-PPG对HepG2的IC50值显著低于PPG，而对L-02细胞的IC50值显著高于PPG，表明与OCT结合后，增强了PPG对HepG2的细胞毒性，降低了对L-02细胞的毒性。考察了OCT对OCT(Phe)-S-PPG细胞毒性的影响，结果显示，OCT显著抑制了OCT(Phe)-S-PPG对HepG2的细胞毒性，表明OCT(Phe)-S-PPG对细胞毒性的增强与SSTRs受体介导的内吞有关。细胞摄取实验也证实了OCT(Phe)-S-PPG能显著增强PPG在HepG2中的吸收。
　　2、OCT(Phe)-S-PPG的组织分布和药效学研究：建立了杠柳苷元在小鼠血浆、脏器和实体瘤组织中分布的HPLC检测方法。建立了H22肝癌实体瘤小鼠模型。考察了OCT(Phe)-S-PPG在小鼠体内的组织分布，并进行了药效学研究。尾静脉注射给药后，OCT(Phe)-S-PPG能显著提高PPG在瘤组织中的分布，同时降低了PPG在心脏和肝脏组织中的分布。药效学研究结果显示，OCT(Phe)-S-PPG对H22实体瘤的抑制率显著高于PPG组（69.4%vs52.18%, P<0.01）。病理切片结果显示，PPG组心脏组织表现为心肌细胞呈不规则排列，有少量炎症细胞浸润，肝组织表现为肝细胞索紊乱，肝细胞发生水泡变性、坏死，肝窦变宽和肝窦淋巴细胞增多，与对照组相比，OCT(Phe)-S-PPG组未见明显病理变化。说明OCT(Phe)-S-PPG能显著降低PPG的心脏和肝脏毒性。以上实验结果表明杠柳苷元偶联奥曲肽后其对肿瘤细胞和肿瘤组织选择性显著提高，同时降低其体内毒性。
　　第四章奥曲肽偶联杠柳次苷靶向治疗肝癌的实验研究
　　本章采用酶解法从香加皮分离纯化得到杠柳次苷，其细胞毒性明显强于杠柳苷元。对杠柳次苷制备工艺进行了优化。合成了奥曲肽-杠柳次苷（OCT-PPM）的偶联物。对多种偶联物进行了表征和细胞毒性研究。建立了杠柳次苷在小鼠血浆、脏器和实体瘤组织中的HPLC检测方法。考察了杠柳次苷和奥曲肽-杠柳次苷偶联物在小鼠体内组织分布特性。以H22肝癌实体瘤为模型，评价了杠柳次苷和奥曲肽-杠柳次苷偶联物的体内抑瘤效果及其心脏和肝脏毒性。
　　1、酶解法转化杠柳毒苷制备杠柳次苷的条件优化：以酶解转化率为指标，考察了温度、PH值、底物浓度、酶量、反应时间等因素对酶解转化率的影响。最佳条件：温度50℃、反应介质pH=5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，底物质量浓度为50 g/L，酶与底物比为0.6:1，反应时间24 h。反应产物相对分子量为534.63，经核磁图谱证实为杠柳次苷，得率为0.075%。
　　2、奥曲肽-杠柳次苷偶联物的合成及其体外细胞毒性的评价：以丁二酸酐为连接剂，合成得到奥曲肽-杠柳次苷偶联物，分别是OCT(Phe)-S-PPM、OCT(Lys)-S-PPM和OCT-2S-2PPM。通过HPLC-UV、红外、核磁共振氢谱对上述三种反应产物进行了表征，结果证实得到了纯度在95%以上的多种奥曲肽-杠柳次苷偶联物。以MTT法评价各种奥曲肽-杠柳次苷偶联物的细胞毒性，结果显示OCT(Phe)-S-PPM对肿瘤细胞MCF-7和HepG2的毒性最强，且显著高于PPM的毒性，而对L-02细胞毒性显著低于PPM。表明OCT(Phe)-S-PPM能提高PPM的抗肿瘤活性并降低对正常肝脏细胞的毒性，具有一定的选择性。
　　3、OCT(Phe)-S-PPM的组织分布和药效学研究：尾静脉注射给药后，PPM在肝脏、肾脏和心脏中分布最多，而在肿瘤组织中分布较少。OCT(Phe)-S-PPM能显著提高PPM在小鼠瘤组织中的分布，并降低PPM在心脏和肝脏组织中的分布。表明OCT(Phe)-S-PPM提高了PPM的肿瘤靶向性和药物递送效率。药效学研究结果显示，PPM和OCT(Phe)-S-PPM组的H22肝癌实体瘤体积均明显低于空白对照组。OCT(Phe)-S-PPM对小鼠H22实体瘤的抑制率为69.4%，显著高于PPM组(52.18%，P<0.01)。病理切片结果显示，PPM组心脏组织表现为心肌细胞排列不规则，伴有淋巴细胞浸润。肝组织表现为肝细胞萎缩、肝细胞索变细、肝窦变宽和肝窦淋巴细胞增多，而OCT(Phe)-S-PPM组未见明显病理变化，肝功能检查结果亦显示OCT(Phe)-S-PPM的肝毒性明显小于PPM，表明OCT(Phe)-S-PPM能显著降低PPM的心脏和肝脏毒性。空白对照组的肿瘤组织表现为肿瘤细胞密集和细胞核浓染。PPM组和OCT(Phe)-S-PPM组的肿瘤细胞数量明显少于空白对照组，且细胞呈坏死状态，而OCT(Phe)-S-PPM组表现的更明显，说明OCT(Phe)-S-PPM能提高PPM的体内抑瘤活性。以上实验结果表明，杠柳次苷偶联奥曲肽后其细胞和肿瘤靶向性得到提高，毒性显著降低，体内抑瘤活性增强，为强心甾类固醇活性成分靶向前体药物关键技术研究奠定了理论基础，提供了创新思路和重要参考。
　　第五章氧化-还原感应性PEG化长循环纳米前药的研究
　　本章采用二硫醇二羟基乙酸作为连接剂，将杠柳次苷和维生素E进行偶联形成前体药物。与甲基醚聚乙二醇2000-亚油酸（mPEG2000-LD）混合溶解在乙醇中，通过纳米沉淀法制备成氧化还原感应性的新型PEG化杠柳次苷-维生素E偶联物自组装纳米前药（MPSSV-NPs）。对该纳米前药进行了表征、稳定性和体外释放研究，对大鼠体内药动学参数、H22肝癌实体瘤小鼠体内组织分布和体内抗肿瘤药效进行了考察。
　　1、新型PEG化杠柳次苷-维生素E偶联物自组装纳米前药（MPSSV-NPs）的制备和表征：以二硫醇二羟基乙酸作为连接剂，合成得到杠柳次苷-维生素E偶联物。同时将甲基醚聚乙二醇2000与亚油酸通过酯化反应合成得到mPEG2000-LD，采用ESI-MS和NMR对产物进行了表征。结果证实合成得到了目标产物杠柳次苷-维生素E偶联物（PPM-S-S-VE）和甲基醚聚乙二醇2000-亚油酸（mPEG2000-LD）。采用纳米沉淀法制备了杠柳次苷-维生素E偶联物纳米前药（PSSV-NPs）和不同含量mPEG2000-LD修饰的杠柳次苷-维生素E偶联物自组装纳米粒前药（MPSSV-NPs）。以动态光散射法测定纳米粒的粒径与Zeta电位。结果显示，随着mPEG2000-LD投入量的增加，其粒径逐渐减少，分散系数均小于0.2。透射电镜观察显示PSSV-NPs和MPSSV-NPs均呈均匀分散的类球状物。稳定性实验结果显示，PSSV-NPs在PBS（pH=7.4）介质中不稳定，而MPSSV-NPs在一个月内粒径无明显变化。体外释放实验结果显示，MPSSV-NPs中PPM的释放和偶联物的降解均具有氧化还原感应性。
　　2、MPSSV-NPs的药动学、组织分布和药效学研究：MPSSV-NPs大鼠体内生物利用度研究结果表明，经尾静脉注射给药后，与原料药相比，Cmax显著降低，而Tmax、t1/2和AUC0-24 h均显著提高，分别提高到8、91.86和21.68倍。与PSSV-NPs相比，Cmax、Tmax、t1/2和AUC0-24 h均显著提高，分别提高到4.43、2.00、8.99和9.25倍。H22肝癌实体瘤小鼠体内组织分布结果表明，PSSV-NPs和MPSSV-NPs主要分布在肝脏、脾和肺脏器中，且显著高于PPM。MPSSV-NPs在肿瘤组织的分布显著高于PSSV-NPs和PPM，而在心脏中分布与PSSV-NPs无显著差异，显著低于PPM。药效学研究结果显示，PPM、PSSV-NPs和MPSSV-NPs组的H22肝癌实体瘤体积均明显低于空白对照组。MPSSV-NPs对小鼠H22实体瘤的抑制率为66.41%，显著高于PPM和PSSV-NPs组。病理切片结果显示，PPM组心脏组织表现为心肌细胞排列不规则、心肌纤维化，伴有淋巴细胞浸润，而PSSV-NPs和MPSSV-NPs组与PBS组无明显差异型。PPM组的肝组织病理切片表现为肝细胞索变细、肝窦变宽和肝细胞萎缩增多，PSSV-NPs组和MPSSV-NPs组的肝组织病理切片表现轻微肝损伤。空白对照组的肿瘤组织表现为肿瘤细胞有丝分裂指数高、细胞密集和浓染的圆形或者椭圆性泡状核，PPM组和PSSV-NPs组的肿瘤细胞数量明显少于空白对照组，且细胞坏死区域面积大于对照组，MPSSV-NPs组细胞坏死状态明显，细胞坏死区域面积大于PPM组和PSSV-NPs组。以上实验结果表明，MPSSV-NPs是一种具有氧化还原感应性的长循环纳米前药，显著延长了PPM体内循环时间、提高了肿瘤组织分布和体内抑瘤效果，为PPM的高效低毒和纳米化靶向给药提供了新方法和新思路。

目录

中英文缩写对照（Abbreviation）

第一章 强心甾类固醇的抗肿瘤研究及前体设计在提高肿瘤靶向性和活性中的应用研究进展

1.1 前言

1.2. 强心苷类甾醇的抗肿瘤研究进展

1.3 前体药物在提高肿瘤靶向性及其活性中的应用研究进展

1.3 强心甾类固醇活性成分的研究展望

4 本论文研究对象、设计思路与构想

第二章 天然产物抗肿瘤活性成分的筛选及其结构分析

第一节 天然产物抗肿瘤活性成分的筛选

第二节 活性成分的结构鉴定及其抗肿瘤活性比较

第三章 奥曲肽偶联杠柳苷元靶向治疗肝癌的实验研究

第一节 奥曲肽-杠柳苷元偶联物的制备及其体外细胞毒性的评价

第二节 OCT(Phe)-S-PPG的组织分布和药效学研究

第四章 奥曲肽偶联杠柳次苷靶向治疗肝癌的实验研究

第一节 酶解法转化杠柳毒苷制备杠柳次苷的条件优化

第二节 奥曲肽-杠柳次苷偶联物的制备及其体外细胞毒性的评价

第三节 OCT(Phe)-S-PPM的组织分布和药效学研究

第五章 氧化-还原感应性PEG化长循环纳米前药的研究

第一节 新型PEG化维生素E-杠柳次苷偶联物纳米粒的制备和表征

第二节 MPSSV-NPs的药动学、组织分布和药效学研究

全文总结与创新点

一、全文总结

二、创新点

参考文献

致谢

攻读博士学位期间已发表或完成的论文

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