表达双功能抗体anti-HER2-anti-CD3 T细胞的构建及其抗癌研究

摘要

癌症是严重威胁人类生存的重大疾病。据国际癌症研究中心统计，全球恶性肿瘤新发病例每年超过1400万，每年因癌症死亡的人数约820万，发病率总体呈增长趋势。人表皮生长因子2(HER2)在高发病率的乳腺癌、胃癌、肺癌等癌细胞中，均存在过表达，且与一些癌细胞的形成与进展有密不可分关系，因此是重要的肿瘤抗原和抑癌的靶标。 基因工程化T细胞，如嵌合抗原受体的T细胞（CAR-T)，是热门的精准细胞治疗手段。称为T细胞结合器的双特异性抗体BiTE也是精准蛋白治疗手段。这两者在临床上均具有相对较好的治疗效果。但是CAR-T细胞不能将大量的常驻T细胞重新定向到肿瘤，限制了其潜在临床疗效。BiTE虽然能够通过桥接作用帮助T细胞靶向杀伤表达BiTE特异识别抗原的肿瘤细胞，但因其体内较短的血清半衰期、不能自我扩增且体内分布不富集于癌病灶区，因此需要连续的输液给药。本研究拟选取HER2作为靶向抗原，结合BiTE与基因工程化T细胞两者的优势，采用慢病毒表达系统基因改造T细胞，使其能够分泌一种“抗HER2抗CD3(anti-HER2-anti-CD3)”的BiTE。这种称为HER2-ENG的T细胞，其具有自我扩增与分泌表达BiTE的优势，并靶向杀伤HER2阳性肿瘤。研究流程和结果如下： 1.通过同源重组法克隆：PCR扩增含anti-HER2-anti-CD3BiTE而两端为15bp载体末端同源序列的DNA片段，在同源重组酶作用下与线性化的pCDH-MCS-EF1-GFP载体质粒重组，经测序验证构建出LV-anti-HER2-anti-CD3BiTE质粒。该质粒与慢病毒辅助质粒共转染293T细胞，获得重组慢病毒。纯化浓缩慢病毒滴度至2x108pfU/mL。 2.构建表达和分泌anti-HER2-anti-CD3的HER2-ENGT细胞。用CD3与CD28抗体刺激外周血单核细胞（PBMC)得到活化的T细胞，将重组慢病毒转导至活化的T细胞中。该重组慢病毒同时表达的荧光蛋白GFP可以用来鉴定和分选表达外源基因的T细胞。流式细胞仪检测GFP表达率为28±1.2%(n=3)，RT-PCR检测发现转导的T细胞中anti-HER2-anti-CD3BiTE的mRNA表达，确定制备出表达anti-HER2-anti-CD3BiTE的HER2-ENGT细胞。用只表达荧光蛋白GFP的慢病毒转导的T细胞作为对照T细胞，用于研究HER2-ENGT细胞的活性。 3.体外检测HER2-ENGT细胞杀伤HER2阳性癌细胞的活性。通过共培养HER2-ENGT细胞与各种肿瘤细胞发现HER2-ENGT在体外具有抗原特异性的抗肿瘤活性。共培养结果表明HER2-ENGT细胞在HER2阳性的靶细胞刺激下，分泌高浓度的IL-2与IFN-Y，从而特异杀伤HER2阳性的靶细胞如MCF-7等，而HER2阴性的MDA-MB-231乳腺癌细胞不能激活HER2-ENGT，没有被杀灭；HER2-ENGT细胞培养上清可帮助PBMC细胞靶向杀伤MCF-7，HER2阳性的靶细胞激活后的HER2-ENGT细胞培养上清的效果更好，这表明HER2-ENGT分泌的anti-HER2-anti-CD3在HER2阳性癌细胞存在时能够特异性激活PBMC细胞。 4.检测HER2-ENGT细胞在体内抑制肿瘤的活性。建立裸鼠的MCF-7异种移植瘤模型。皮下注射4x106的MCF-7到4周龄的雌性裸鼠右腋下，1周后形成微小瘤灶。尾静脉注射1x107的HER2-ENGT细胞，以未转导的活化T细胞或PBS注射组为对照组，在肿瘤接种4周后，测量了各组的肿瘤体积。与尾静脉注射的未转导T细胞与PBS对照组比较，HER2-ENGT细胞治疗组的肿瘤体积更小，小鼠活力较好。初步验证其在小鼠体内有一定抑瘤效果，有可能应用于癌症治疗。

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