磁性核-壳生物高分子纳米颗粒的制备及用于β-葡萄糖苷酶(CfGlu1B)的分离纯化和活性改进

摘要

本研究合成了一种“核-壳”结构的磁性生物高分子纳米颗粒，将其用于分离纯化融合蛋白及改良蛋白的活性。以带六聚组氨酸标签的CfGlu1B（台湾家白蚁三种内源性β-葡萄糖苷酶中的一种）为对象，研究了该磁性纳米颗粒在分离纯化CfGlu1B和改进酶活性方面的应用，结果如下：
　　（1）通过蒸馏沉淀聚合法制备的磁性纳米颗粒Fe3O4/PMG/IDA-Ni2+，通过透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、热重分析仪（TGA）、X射线衍射仪（X-ray）以及强磁场震动样品磁强计（VSM）表征磁性纳米颗粒的形态结构、组成和磁性能等理化特征。结果显示Fe3O4/PMG/IDA-Ni2+为“核-壳”结构，直径约为350 nm；相应官能团的特征吸收峰明显；饱和磁化量为20.7 emu/g，对外加磁场响应灵敏。
　　（2）研究磁性纳米颗粒在分离纯化融合蛋白CfGlu1B（His-CfGlu1B）方面的应用。首先确定带His标签的CfGlu1B融合蛋白和磁性纳米颗粒的特异性结合，对比目标磁性纳米颗粒以及中间产物颗粒分别与含 His-CfGlu1B蛋白的溶液孵育后的SDS-PAGE和溶液中剩余酶活的变化，确定了His-CfGlu1B特异性结合目标磁性纳米颗粒，不会与中间产物颗粒发生非特异性吸附；其次比较该磁性纳米颗粒与商业化纯化材料的纯化效率的差异，选取两种商业化纯化材料（GenScript）无磁性镍柱High Affinity Ni-NTA Resin和（Thermo Scientific）磁性镍柱HisPurTM Ni-NTA Magnetic Beads，纯化后His-CfGlu1B的比活和总活力回收率结果显示三种材料的纯化效率相当，纯化后CfGlu1B的比活如下：无磁性镍柱（45.09 U/mg）略大于磁性纳米颗粒（42.61 U/mg），略高于磁性镍柱（40.86 U/mg）；蛋白CfGlu1B的总活力回收率如下：无磁性镍柱（77.3%）大于磁性镍柱（63.2%），高于磁性纳米颗粒（60.6%）。
　　（3）研究磁性纳米颗粒作为固定化酶载体对酶动力学参数的影响。研究了固定化过程的三个主要影响因素：His-CfGlu1B蛋白量/载体（μg/mg）、孵育时间和孵育温度。三个因素分别对固定化His-CfGlu1B活性作曲线，得出固定化最佳条件：蛋白量/载体是120μg，孵育时间30 min，孵育温度25℃。在最佳条件下测定磁性纳米颗粒的固载量约为60 mg/g。固定化对His-CfGlu1B动力学参数影响的研究结果表明，固定化His-CfGlu1B（Km=3.4±0.4 mM）对底物p-NPG的亲和力高于游离的（Km=4.2±0.3 mM），固定化His-CfGlu1B的催化效率（Kcat/Km=13.5±0.7 S-1 mM-1）略低于游离的（Kcat/Km=14.0±0.7 S-1 mM-1）。
　　（4）研究磁性纳米颗粒作为固定化载体在活性改良方面的应用价值。首先研究载体和His-CfGlu1B酶的结合稳定性，固定化的酶在4℃放置20天后未能检测到载体和His-CfGlu1B酶的分离，说明His-CfGlu1B酶与磁性纳米颗粒间的结合稳定。其次研究固定化酶的热稳定性，固定化His-CfGlu1B在60℃温育30分钟后，残留活性是原活性的75%，而游离His-CfGlu1B在60℃温育30分钟后，残留活性检测不到；固定化His-CfGlu1B在25℃放置20天后酶活剩余70%，而游离His-CfGlu1B在25℃放置20天后酶活剩余20%，这说明固定化His-CfGlu1B的热稳定性远高于游离的酶。最后检测了固定化His-CfGlu1B酶可重复使用次数，固定化酶在11次重复使用后仍维持约70%的原酶活性，改善了游离酶难以重复利用的缺点。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 磁性纳米材料

1.2 蛋白质的分离纯化

1.3 固定化酶

1.4 选题理由与意义

1.5 研究内容和技术路线

第二章 单分散的功能化磁性纳米颗粒的合成

2.1 实验材料

2.2 磁性纳米颗粒的制备

2.3 表征方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 磁性纳米颗粒分离纯化CfGlu1B酶的研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 磁性纳米颗粒对His-CfGlu1B酶活性改良的研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

致谢

在学期间的学术成果