脓毒症时细菌内毒素通过自分泌ATP/P2X1/Ca2+通路对中性粒细胞趋化的抑制作用及机制

摘要

背景：脓毒症是指宿主对感染的反应失调，产生危及生命的器官功能障碍，是严重创伤、烧伤、休克后常见的并发症。近年来，尽管在严重脓毒症及脓毒性休克的抗感染、液体复苏、创面处理、器官支持治疗等方面已取得进展，但其病死率仍居高不下，是重症监护室(intensive care unit，ICU)病人的首要死亡原因。脓毒症患者免疫功能受到抑制，自身清除感染的能力降低，是患者感染难以控制的重要原因。抗生素的使用提高了脓毒症患者的救治成功率，但随着抗生素的长期应用，不敏感菌株大量繁殖，抗生素不能完全解决脓毒症时的感染问题。因此，如何改善脓毒症时患者自身的免疫功能从而有效地控制感染，是脓毒症防治的重要课题。脓毒症时，在多种细菌毒素及细胞因子的刺激下，中性粒细胞功能失调，趋化方向性受损，到达病原感染部位的中性粒细胞数量减少，不能有效抑制病原增殖，导致机体抵御感染的能力降低，影响重要脏器的功能，是脓毒症患者死亡的重要原因之一。进一步阐明脓毒症时中性粒细胞方向性受损的机制，寻找针对性的干预措施，使中性粒细胞向感染部位的趋化增强，可为脓毒症的抗感染治疗提供理论基础。
　　内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁表面的主要组成成分，过量的LPS可导致天然免疫细胞的过度活化，释放过多的炎症介质，通过自分泌、旁分泌和体循环作用于全身组织器官，是引起脓毒症时全身炎症反应综合征的重要原因。ATP是细胞内重要的能量分子，近年来，Junger等人发现中性粒细胞也可通过自分泌ATP途径对自身的趋化产生影响。中性粒细胞趋化时前端片足分泌的ATP通过自分泌途径激活自身局部的P2Y2受体，增强了细胞的运动功能，但当细胞整体都接受ATP的刺激时，中性粒细胞的趋化功能反而受到抑制，这提示胞外ATP亦可能是中性粒细胞趋化的抑制分子，但其具体分子机制目前并不明确。P2X1受体是ATP门控阳离子通道受体，与ATP结合后能迅速诱导细胞的Ca+内流，是细胞重要的Ca2+内流通道。近年来的研究证实P2X1受体也表达于外周血中性粒细胞中，ATP可通过活化P2X1受体增强中性粒细胞的随机运动，但随机运动的中性粒细胞不具有方向性，损伤了其向趋化物的定向运动能力，减弱了中性粒细胞向感染部位的特异性趋化能力。Ca+是细胞内重要的信号分子，参与调控了中性粒细胞的多种生物学功能，但过度的Ca2+内流对中性粒细胞的趋化则具有抑制作用，但其是否与P2X1受体的活化有关目前尚不明确。
　　方法：体内实验采用致死剂量和非致死剂量的大肠埃希菌腹腔注射，制作脓毒症感染小鼠模型和轻度局部感染小鼠模型，观察小鼠生存率，血细胞自动分析仪检测腹腔灌洗液、血液中性粒细胞数量，平板菌落计数法检测腹腔灌洗液、血液细菌含量。病理切片HE染色观察小鼠脓毒症后肝、肺损伤，ELISA试剂盒检测肝、肺IL-1β、IL-6细胞因子水平，MDA试剂盒检测肝、肺MDA含量，转录谱基因芯片检测中性粒细胞基因表达的差异。
　　体外实验采用LPS刺激原代中性粒细胞模型，琼脂糖趋化实验检测中性粒细胞趋化距离，流式细胞仪检测中性粒细胞趋化分子受体表达及凋亡，高效液相色谱仪检测ATP释放，Western Blot检测Cx43蛋白磷酸化，激光共聚焦显微镜检测P2X1受体分布、Ca2+内流，原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化，激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白肌球蛋白轻链(myosin lightchain，MLC)磷酸化、极性化。
　　采用CRISPR/Cas9慢病毒敲除HL-60早幼粒细胞株P2X1受体，1.3％二甲基亚砜处理HL-60细胞6d后分化成类中性粒细胞，原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化，激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白MLC磷酸化、极性化。
　　结果：体内研究发现脓毒症时中性粒细胞趋化功能受到抑制、清除感染能力受损，肝、肺组织病理损伤明显、炎症反应增强，进一步的基因芯片检测发现脓毒症时中性粒细胞TLR信号通路活化，LPS通过TLR4对中性粒细胞多种的趋化分子受体的表达产生调控作用。
　　体外研究发现在脓毒症时重要的炎症刺激分子中LPS对中性粒细胞趋化的抑制作用最为明显，LPS通过促进Cx43通道开放分泌ATP，ATP作用于自身P2X1受体后引起过量的Ca2+内流，使中性粒细胞钙调蛋白MLCK活化，导致MLC异常磷酸化及极性化，抑制了中性粒细胞的趋化。P2X1受体敲除后，LPS对中性粒细胞的抑制作用被削弱，MLC磷酸化、极性化恢复正常。
　　结论：本研究通过体内、体外研究发现了LPS刺激后自分泌ATP/P2X1/Ca2+信号通路对中性粒细胞趋化的抑制作用，并揭示其对中性粒细胞骨架蛋白MLC异常极性化的作用及机制，这可能是脓毒症时中性粒细胞趋化受损的重要原因之一。

目录

声明

摘要

英文缩写检索

第一章 绪论

1．1．2 、中性粒细胞的骨髓动员

1．1．3 、中性粒细胞对病原的直接清除

1．1．4 、中性糊胞与其他免疫细胞协同清除病原

1．2 、中性粒细胞招募

1．2．1 、中性粒细胞跨膜迁移

1．2．1 、中性粒细胞定向趋化

1．3 、脓毒症时中性粒细胞趋功能受损

1．3．1 、脓毒症的定义

1．3．2 、脓毒症时免疫功能失调

1．3．3 、脓毒症的免疫治疗

1．3．4 、脓毒症时感染难以控制

1．3．5 、脓毒症时中性粒细胞向病原部位趋化能力减弱

1．4 、细菌内毒素对中性粒细胞功能的调控

1．4．1 、细菌内毒素

1．4．2 、细菌内毒素促进中性粒细胞ROS生成

1．4．3 、细菌内毒素促进中性粒细胞粘附

1．4．4 、细菌内毒素促进中性粒细胞脱颗粒

1．4．5 、细菌内毒素使中性粒细胞趋化方向性受损

1．5 、胞外ATP与中性粒细胞趋化

1．5．1 、胞外ATP通过P2受体家族活化免疫细胞

1．5．2 、胞外ATP对中性粒细胞活化的调控

1．5．3 、中性粒细胞自分泌ATP对趋化的调控

1．6 、P2X1受体与中性粒细胞趋化

1．6．1、P2X1受体功能及分布

1．6．2、P2X1受体对中性粒细胞趋化的影响

1．7 、Ca2+动员与中性粒细胞趋化

1．7．2 、内质网Ca2+释放途径

1．7．3 、Ca2+内流途径

1．7．4 、Ca2+动员对中性粒细胞趋化的影响

1．8 、中性粒细胞趋化时发生极性化

1．8．1 、中性粒细胞极性化的概念

1．8．2 、中性粒细胞极性化的调控

1．8．3 、肌球蛋白轻链激酶对中性粒细胞极性化的影响

1．9 、本研究的目的、方法、实验设计和意义

1．9．4 、研究意义

第二章 、脓毒症时中性粒细胞趋化受损

2．1 、引言

2．2 、实验仪器与试剂

2．2．1 、实验仪器

2．2．2 、实验耗材

2．2．3 、实验耗材

2．3 、实验方法

2．3．3 、腹腔灌洗液及血液E.coli计数及鉴定

2．3．4 、收集小鼠肝、肺组织

2．3．5 、病理苏木精伊红(hematoxylin eosin，H＆E)染色

2．3．6 、细胞因子测定

2．3．7 、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定

2．3．7 、中性粒细胞分离

2．3．8 、总RNA抽提与质检

2．3．9 、基因芯片检测及验证

2．3．1 0、统计分析

2．4 、实验结果

2．4．1 、脓毒症小鼠中性粒细胞趋化受损、清除感染能力下降

2．4．2 、脓毒症小鼠肝、肺炎症反应明显

2．4．3 、脓毒症小鼠中性粒细胞转录组基因芯片分析

2．4．4 、细菌LPS对小鼠中性粒细胞趋化因子表达的影响

2．5 、讨论

第三章 、细菌内毒素通过激活自分泌ATP／P2X1／Ca2+信号通路抑制中性粒细胞趋化

3．1 、引言

3．2 、实验仪器与试剂

3．2．1 、实验仪器

3．2．2 、实验耗材

3．2．3 、实验试剂

3．3 、实验方法

3．3．1 、外周血中性粒细胞分离及干预

3．3．2 、琼脂糖趋化实验

3．3．3 、中性粒细胞胞膜趋化因子表达

3．3．4 、中性粒细胞凋亡

3．3．5 、ATP释放

3．3．6 、Western Blot

3．3．7 、蛋白共定位

3．3．8 、Ca2+动员

3．3．10、统计分析

3．4 、实验结果

3．4．1 、细菌LPS抑制中性粒细胞趋化

3．4．2 、其他脓毒症重要炎症刺激物对中性粒细胞趋化的影响

3．4．3 、细菌LPS对中性粒细胞胞膜趋化分子受体表达的影响

3．4．4 、细菌LPS对中性粒细胞凋亡的影响

3．4．5 、细菌LPS刺激后中性粒细胞通过开放Cx43通道分泌ATP

3．4．6 、细菌LPS通过自分泌ATP对中性粒细胞趋化的抑制作用

3．4．7 、细菌LPS通过P2X1受体抑制中性粒细胞趋化

3．4．8 、细菌LPS通过自分泌ATP活化P2X1受体

3．4．9 、细菌LPS通过自分泌ATP／P2X1受体通路引起持续Ca2+内流

3．4．1 0、LPS通过自分泌ATP／P2X1受体通路引起的Ca2+内流抑制中性粒细胞趋化

3．5 、讨论

第四章 、内毒素通过自分泌ATP／P2X1／Ca2+信号通路调控中性粒细胞骨架蛋白异常极性化、磷酸化

4．1 、引言

4．2 、实验仪器与试剂

4．2．1 、实验仪器

4．2．2 、实验耗材

4．2．3 、实验试剂

4．3 、实验方法

4．3．1 、琼脂糖趋化实验

4．3．2 、扫描电子显微镜

4．3．3 、原子力显微镜

4．3．4 、激光共聚焦显微镜

4．3．6 、HL-60细胞分化

4．3．7 、统计分析

4．4 、实验结果

4．4．2 、自分泌ATP／P2X1／Ca2+信号通路对细菌LPS刺激后中性粒细胞骨架蛋白肌球蛋白轻链极性化、磷酸化的影响

4．4．3 、细菌LPS通过肌球置白轻链激酶抑制中性粒细胞趋化

4．4．4 、P2X1受体敲除和过表达对细菌LPS刺激后类中性粒细胞趋化的影响

4．4．5 、P2X1受体敲除和过表达对细菌LPS刺激后类中性粒细胞趋化时极性化的影响

4．4．6 、P2X1受体敲除和过表达对细菌LPS刺激后类中性粒细胞骨架蛋白MLC极性化、磷酸化的影响

4．4 、讨论

结论

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文及其他科研成果