透明质酸锌的制备及XRF质控方法研究

摘要

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病的一种，病因尚不明确，多发于20-30岁人群，其病变部位位于乙状结肠和直肠，其表现形式为腹痛、便血、体重减轻、里急后重、呕吐等，临床上其主要特点为结肠内壁出现溃疡。有部分研究表明锌作为一种人体必需的微量元素，参与体内多种酶、核酸和蛋白的合成，与人体内细胞分裂，生长和再生息息相关，还有一定的抑菌作用，而透明质酸（Hyaluronic acid，HA）在伤口愈合的过程中，具有降低炎症介质水平的作用，同时其能在溃疡表面形成微酸性环境，抑制细菌生长。二者结合形成的透明质酸锌（Zinc hyaluronate，ZnHA）具有良好的协同作用，可治疗角膜溃疡和糖尿病足溃疡等疾病。 本论文摸索了ZnHA的制备工艺，对其进行了优化及表征，并使用了能量色散X射线荧光（Energy dispersive X-ray fluorescence，EDXRF）法对其中的锌含量进行了质控，并成功构建了UC的动物模型。并通过HE染色，免疫组化等动物实验研究ZnHA对UC的抑制作用。 主要研究内容包括以下三个方面： （1）单因素考察透明质酸钠（Sodium hyaluronate，SH）分子量、锌盐种类、乙醇浓度、锌盐浓度、反应温度和反应时间对ZnHA中葡萄糖醛酸含量的影响，然后通过正交实验筛选优化实验方案，结果制备 ZnHA 的最佳试验条件为：SH分子量为130万、锌盐选用乙酸锌、乙醇浓度80%、锌盐浓度2%、反应时间40℃、反应时间1小时，此条件下制备的ZnHA中葡萄糖醛酸含量为43.18%。 （2）建立EDXRF法应用于ZnHA中锌含量的测定。用0.3%浓度的透明质酸钠溶液作为空白基质，精密加入不同量的硫酸锌溶液，建立元素标准曲线。以0.3%浓度的ZnHA溶液作为样品溶液。在管压为40KV，管流150mA，1号准直器，3号滤光片的条件下测定锌含量。且本法与药典中收载的EDTA-2Na测锌元素方法比较，测定结果经t检验无显著性差异（P＞0.05）。 （3）Balb/C小鼠40只随机分为正常组，模型组，硫酸锌组、透明质酸钠组、阳性药柳氮磺吡啶组，低、中、高剂量ZnHA组，每组5只。除正常组外，其余各组自由饮用5%葡聚糖硫酸钠盐（Dextran sodium sulfate，DSS）7天诱导UC，除模型组，给药组均以灌胃的方式给药。通过HE染色，免疫组化，炎症因子和western blot来判断ZnHA对溃疡性结肠炎的抑制效果。结果HE染色显示中剂量ZnHA组和柳氮磺吡啶组溃疡较少，免疫组化结果显示这两组阳性率高于其他给药组。与正常组相比，中剂量ZnHA组与柳氮磺吡啶组小鼠体内炎症因子水平与紧密连接蛋白含量之间没有显著性差异（P＞0.05）。结论：ZnHA 对溃疡性结肠炎有一定的抑制作用。 综上所述，本文确定了ZnHA的最优制备工艺，建立了一种新型测定其锌含量的方法，可以用于其制备过程控制，并成功构造了溃疡性结肠炎的动物模型，验证了ZnHA对溃疡性结肠炎的抑制作用。

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