利用mRNA重编程系统高效率生成瘢痕疙瘩诱导多能性干细胞的研究

摘要

目的： 瘢痕疙瘩凭借高复发率和低治愈率成为皮肤科较为棘手的疾病之一，我们需要针对此类疾病开发新的诊疗技术。目前，有关诱导多能性干细胞（ ind uced pluripotent stem cells ，iPSCs）研究十分热门，本课题组通过在体外重编程来自瘢痕疙瘩病人病变处的成纤维细胞成为iPSCs，为瘢痕疙瘩疾病寻找可以提供干细胞疗法的新思路。 方法： 首先，我们从瘢痕疙瘩病损组织中分离出成纤维细胞，并从细胞和组织两方面检测疾病相关性基因的表达。然后，通过用非修饰性mRN As转染患者成纤维细胞，过表达OCT4，SOX2，KLF4，cMYC，NANOG和LIN28重编程因子来产生相应的iPSCs。最后，利用碱性磷酸酶染色，细胞免疫荧光，多能性基因检测，成纤维细胞基因沉默，体外拟胚体形成和重度免疫缺陷性小鼠体内畸胎瘤形成来鉴定这些患者衍生的iPSCs的功能性。 结果： 本课题组利用瘢痕疙瘩病人病损处组织所分离出来的成纤维细胞高表达成纤维细胞相关性基因；在瘢痕疙瘩组织中TGF-β1、COLIA2、FGF7、MMP14基因表达高于正常组织，且有统计学意义（P>0.05）；在瘢痕疙瘩病损处来源的成纤维细胞中cTGF、TGF-β1、COLIA2表达高于正常成纤维细胞，且有统计学意义（P>0.05）； 利用mRN A转染法重编程，经过4次转染后，成纤维细胞出现明显上皮样改变，逐渐出现排列致密，边缘清晰的类ES（Embryonic Stem）细胞样克隆；来自瘢痕疙瘩病人的iPSCs多能性标志物表达阳性，同时其内源性多能性基因高表达，成纤维细胞特异性基因沉默，并且可以在体外持续扩增。此外，瘢痕疙瘩病人来源的iPSCs可以在体外形成拟胚体，并在体内形成畸胎瘤，其向内胚层、中胚层、外胚层三胚层分化的能力也得到证实。 结论： 瘢痕疙瘩患者病损处的成纤维细胞可以在体外成功重编程为iPSCs。本课题组利用效率较高的 mRN A转染法，这种重编程方法可重复率高，可以为生产个体化基因修饰的人造皮肤提供基础，自体干细胞构建的人造皮肤可以防止异种皮肤移植的免疫排斥性和自体皮肤移植后的创伤性。此外，这些细胞可以为瘢痕疙瘩发病机制研究和个体化药物筛选提供细胞模型。

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Phosphate Buffer Solution

第一章 绪论

1.1瘢痕疙瘩概述

1.2 诱导多能性干细胞与其重编程方法概述

1.2.1 诱导多能性干细胞概述

1.2.2 重编程方法概述

1.3 本论文研究目的和实验设计

1.3.1 研究目的

1.3.2 实验设计

第二章 瘢痕疙瘩患者组织与细胞鉴定

2.1 实验材料和试剂

2.1.1 组织标本信息

2.1.2 主要仪器、耗材和试剂

2.2 实验步骤

2.2.1 原代瘢痕疙瘩病人成纤维细胞的分离

2.2.2 瘢痕疙瘩病人成纤维细胞培养

2.2.3 实时荧光定量聚合酶链式反应分析(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction， RT-PCR)

2.2.4 组织免疫荧光染色

2.2.5 制作石蜡切片

2.2.6 苏木素-伊红（HE）染色

2.2.7 统计学方法

2.3 实验结果

2.3.1 瘢痕疙瘩组织病理HE染色

2.3.2 瘢痕疙瘩组织I型胶原免疫荧光

2.3.3 原代瘢痕疙瘩病人成纤维形态观察

2.3.4 成纤维特异性基因检测

2.3.5 瘢痕疙瘩特异性基因检测

2.4 讨论

瘢痕疙瘩是一类结缔组织异常增生性疾病，可以继发于外界刺激，如手术、外伤等，有家族史的一类病人也可以无特殊刺激即发生，其生长多呈浸润性，无界限性，常常侵犯周围皮肤附属器，虽然目前治疗方法较多，包括手术、局部注射、放射疗法、压力疗法、激光疗法等，但都不能达到满意的效果，瘢痕疙瘩的高复发和难治愈的特点使它成为对于皮肤科医师来说较为棘手的疾病之一。

如前所述，瘢痕疙瘩的发病机制包括生长因子异常、ECM异常、胶原蛋白异常、张力因素、遗传免疫异常、基因突变。其中胶原蛋白是ECM的主要组分，但在瘢痕疙瘩的发病机制中，胶原蛋白异常起到重要作用，因此学者常将其单独分类。本章实验研究和比较瘢痕疙瘩组织和细胞瘢痕相关生长因子、胶原蛋白基因表达，且进一步分析其在瘢痕疙瘩发生中所起作用。

根据本章实验结果，在瘢痕疙瘩组织和细胞中成纤维细胞生长因子7（Fibroblast growth factor 7，FGF7）mRNA表达量均较正常对照组上升，其中组织中的表达差异具有统计学意义，FGF7是FGF家族中代表性成员，具有广泛的促进有丝分裂作用，参与许多生物活动，比如胚胎发育、细胞生长、组织修复、形态变化、肿瘤生长及侵袭等等，有报道显示FGF促进有丝分裂作用主要表现在角质形成细胞，而不是成纤维细胞和内皮细胞[49]。在小鼠和大鼠同系动物研究显示，FGF7在上皮形态的发生和伤口再上皮化...

ECM是支持细胞分泌的细胞外大分子集合，是由纤维蛋白和糖胺聚糖组成的网状结构，起到细胞结构支持作用，ECM在细胞粘附，细胞间交流和细胞分化中都发挥着重要作用。ECM的主要成分有1.蛋白多糖与氨基聚糖；2.非胶原糖蛋白：纤粘连蛋白、层粘连蛋白等；3.结构蛋白：胶原蛋白、弹力蛋白。其中胶原蛋白是ECM中含量最丰富的蛋白质[55]。胶原蛋白根据其结构类型可以分成以下几个家族：纤维状（I-III型，V型，XI型）；纤维结合胶原（IX型，XII型）；短链（VIII型，X型）；基膜（IV型）；其他（VI型，V...

本章成功在体外分离出瘢痕疙瘩病人的成纤维细胞，并从组织和细胞两方面证明了瘢痕疙瘩疾病的特异性，完成个体化iPS细胞重编程工作的第一步。

第三章 重编程瘢痕疙瘩患者诱导多能性干细胞

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 主要仪器、耗材与试剂

血清替代物（KSR）

3.2 实验步骤

3.2.1 制备MEF饲养层

3.2.2 制作浓缩病毒

3.2. 3 浓缩病毒重编程

3.2.4 mRNAs重编程

3.2.5 iPS细胞培养

3.2.6 检测浓缩病毒法重编程内源性四因子表达

3.2.7 检测浓缩病毒法感染效率

3.3 实验结果

3.3.1 浓缩病毒法重编程细胞形态观察

3.3.2 浓缩病毒法重编程内源性四因子基因检测

3.3.3 检测浓缩病毒法感染效率

3.3.4 mRNAs法重编程细胞形态观察

第四章 瘢痕疙瘩患者诱导多能性干细胞鉴定

4.1 实验材料与试剂

4.1.1 主要仪器、耗材与试剂

4.2 实验步骤

4.2.1 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）染色

4.2.2 细胞免疫荧光染色

4.2.3 检测KD-iPSCs内源性多能性基因表达

4.2.4 检测KD-iPSCs成纤维基因沉默

4.2.5 KD-iPSCs形成拟胚体

1. 弃液：取状态较好的KD-iPSCs，吸弃培养基；

2. 消化：PBS缓冲液洗1次，用胰蛋白酶-KSR消化37℃，3分钟；

3. 离心：吸弃胰蛋白酶-KSR，PBS缓冲液洗1次，用mTeSR重悬，离心800rmp，3分钟；

5. 每隔2天换液，观察是否形成拟胚体。

4.2.6 畸胎瘤实验

1. 提前购买4周龄的雄性NOD-SCID小鼠；

2. 取生长状态好，增殖力强，处于对数生长期的iPSCs进行畸胎瘤实验；

3. 取6cm培养皿培养的iPSCs，细胞密度在80%~90%进行消化，用mTeSR培养基重悬计数后放冰上；

4.2.7 统计学方法

4.3 实验结果

4.3.1 AP染色

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4.3.2 多能性标志物细胞免疫荧光染色

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4.3.3 检测KD-iPSCs内源性多能性基因表达

4.3.4 检测KD-iPSCs成纤维基因沉默

4.3.5 KD-iPSCs拟胚体形成

4.3.6 畸胎瘤实验

4.4 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

攻读硕士期间发表论文

致 谢

感谢师姐李淑和黄建玲，将实验技术毫无保留地传授给我，并且不厌其烦地为我解释疑惑，对我的成长起到很大作用。