纤维素酶的热保护及其固定化技术研究

摘要

作为广泛应用的酶之一，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合纤维素酶在食品、造纸、纺织、动物饲料等诸多行业起着重要作用。然而，游离的纤维素酶易受外界环境作用导致酶活性损失，以及难于回收等特点造成了酶的使用成本过高，限制了其大规模的工业化应用。通过酶活性保护作用可以解决目前所面临的这些应用难题。纤维素是地球上含量最为丰富的可再生资源之一，却没有得到有效利用，甚至其废弃物对环境造成了一定的破坏。利用纤维素酶降解纤维素得到葡萄糖，再进一步发酵可制得生物燃料乙醇，能够有效地缓解人类目前面临的能源危机。 实验以大分子聚乙二醇单甲醚为基础，合成亲水性的大分子单体PEG-MA，再进一步与单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）合成聚合度为46的共聚物PEG-g-PDMAEMA。在中性条件下，加入4 mg/mL的带正电荷的共聚物与0.5 mg/mL 的活性区域带负电荷氨基酸的纤维素酶通过静电作用相结合，共聚物覆盖在酶的活性区域，从而屏蔽外界环境等不利因素。常温条件下加入20 mg/mL带负电荷的聚丙烯酸，与PEG-g-PDMAEMA形成更强有力的静电作用，纤维素酶得以解吸，从而酶活性几乎全部恢复。此两步法人工分子伴侣PEG-g-PDMAEMA/PAAc 体系的构建在对酶活力的“开/关”调控基础上对纤维素酶具有热保护作用。将PEG-g-PDMAEMA/纤维素酶复合物在90℃下保持20 min，仍有58%的相对酶活力得以恢复。 通过两种单体甲基丙烯酰胺（MAA）和丙烯酸（AAc）合成可溶-不溶性UCST型共聚物PMAAc。50℃下，40μg/mL的戊二醛活化载体氨基5 h，随后共价作用“柔性”固定化纤维素酶，其UCST为19℃。对固定化条件进行了优化，35℃下，4 mg/mL的纤维素酶在pH=5.0缓冲溶液中固定化4 h，酶的固载量达到46.6 mg/g的最佳值。固定化后的纤维素酶拓宽了pH和温度作用范围，且稳定性有了显著提高。由于 β-葡萄糖苷酶在复合纤维素酶中的含量较低，而 β-葡萄糖苷酶是各组分酶水解协同作用的最后关键一步，因此以 β-葡萄糖苷酶为补充酶，与2.5倍量的纤维素酶共同固定化后进行水解，其在24 h后达到平衡的糖化率是单独的固定化纤维素酶水解的近3倍，且重复水解反应8次后，依然有61%的糖化率。 β-葡萄糖苷酶在聚合物PVP保护作用下，与乙酸铜和对氨基苯甲酸(PABA)混合液共沉淀合成基于金属有机框架Cu(PABA)的固定化酶β-G@Cu(PABA)。优化后的乙酸铜和对氨基苯甲酸的浓度分别为50 mM和12.5 mM，共沉淀在pH为7.0的乙酸钠-乙酸缓冲液中进行，酶浓度选择为2 mg/mL，固定化8h后的固载量及保留酶活力达到最佳值，分别为162.95 mg/g和81.89%。Cu(PABA)骨架的三维孔道结构为β-葡萄糖苷酶提供了刚性屏蔽环境，显著提高了其稳定性及有机溶剂耐受性。将β-G@Cu(PABA)和PMAAc-纤维素酶共同催化CMC，并与单独PMAAc-纤维素酶水解进行对比。水解12 h后达到平衡，在纤维素酶等量条件下，两种固定化酶共同水解的糖化率较单独固定化PMAAc-纤维素酶提高近一倍，水解循环8次后，得到超过70%的糖化率。

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