那不勒斯热袍菌木聚糖酶B的超量表达、酶学性质及其嗜热性的研究

摘要

木聚糖是一类重要的木质纤维素生物质资源。而木聚糖酶是木聚糖降解酶系中关键的一类酶，在生物质降解及转化中起着重要作用，同时木聚糖酶在工业上也有着广泛的应用，如饲料行业、食品行业、制浆造纸行业等。天然木聚糖酶由于其产量低，热稳定性差，无法在工业上实现大规模生产及应用。开发新的嗜热细菌来源的木聚糖酶基因和通过蛋白质工程技术改造木聚糖酶的热稳定性是降低木聚糖酶工业应用成本的有效途径。那不勒斯热袍菌是一种超嗜热菌，可产生多种耐热水解酶。本文首次从那不勒斯热袍菌中克隆出木聚糖酶B的基因序列，运用基因工程的技术手段实现了木聚糖酶 B 基因在大肠杆菌中的超量表达，鉴定了该木聚糖酶的酶学性质，并通过蛋白质半理性设计的方法研究木聚糖酶 B的嗜热性。主要的研究内容与结果如下： （1） 运用基因工程的技术研究那不勒斯热袍菌来源的木聚糖酶B在大肠杆菌中的的超量表达。以那不勒斯热袍菌的基因组为模板，利用 PCR 技术扩增编码木聚糖酶B的成熟肽序列；采用新型的热激表达载体pHsh-T载体，构建重组表达质粒pHsh-xlnB；通过热激诱导实现木聚糖酶B在大肠杆菌宿主细胞中的高效表达。 （2） 重组木聚糖酶Tne-xlnB的纯化和酶学性质研究。利用热处理技术和镍亲和层析的方法对重组木聚糖酶进行纯化；对木聚糖酶 Tne-xlnB 进行酶学性质的鉴定，木聚糖酶Tne-xlnB的最适温度为75℃，最适pH为6.0，通过对木聚糖酶Tne-xlnB的酶动力学参数检测发现，Tne-xlnB对桦木木聚糖的Km值和最大反应速度分别为1.086 mg/mL和191.76 U/mg；然后进一步研究了不同金属离子对Tne-xlnB的酶活力的影响，研究结果发现1 mM Mg2+、Co2+、Sr3+、Ba2+、Ca2+对Tne-xlnB酶促反应有促进作用，1 mM Zn2+、Cd2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Cr3+对Tne-xlnB酶促反应有强烈的抑制作用，1 mM Fe2+ 和Mn2+对Tne-xlnB催化反应有微弱的抑制作用，而1 mM K+、Na+、NH4+、EDTA对Tne-xlnB催化活性几乎没有影响。 （3） 木聚糖酶Tne-xlnB的嗜热性研究。通过对木聚糖酶Tne-xlnB与海栖热袍菌木聚糖酶 B 进行氨基酸序列的同源性分析及蛋白结构模拟，初步确定了影响该酶热稳定性的C端关键氨基酸位点；对木聚糖酶Tne-xlnB的α10螺旋、α11螺旋、α12螺上的氨基酸进行定点突变；以重组质粒pHsh-xlnB为模板，利用反向PCR技术，成功构建了突变体Tne-xlnB-α10/11/12；将构建成功的突变体表达质粒转化到大肠杆菌中，实现了高效表达；利用热处理和镍亲和层析的方法纯化突变体并测定了突变体的酶学性质。Tne-xlnB-α11/12和Tne-xlnB-α10/11/12的最适温度分别为80℃和85℃；Tne-xlnB-α11/12在90℃水浴中保温2.5 h，残余酶活为 45.21%，而原始酶 Tne-xlnB 的残余酶活为 38.72%；Tne-xlnB 和Tne-xlnB-α10/11/12在90℃水浴中保温1 h 后，残余酶活分别为55%以上和77%以上；Tne-xlnB-α10/11/12对桦木木聚糖的Km值为0.2943 mg/mL和Vmax为376.42 U/mg；综上，突变体Tne-xlnB-α11/12、Tne-xlnB-α10/11/12的热稳定性显著高于原始酶Tne-xlnB。

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