负载穿心莲内酯的生物伪装磁性纳米载体用于内毒素血症治疗的研究

摘要

内毒素血症是现代临床医学中所面临的一个常见而复杂的难题。其发病机制一般为病灶部位的革兰氏阴性菌被杀灭或凋亡后，细胞壁上的内毒素被释放出来进入血液系统而引发机体炎症反应和微循环障碍等一系列症状。细菌内毒素的分子结构为脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），其结构的稳定性使得常规除菌方法无法去除内毒素，目前针对内毒素血症的治疗大多集中在改善或对抗内毒素所引起的炎症反应，微循环障碍等的对症治疗。内毒素致病作用的分子机制一般被认为是LPS与机体内巨噬细胞或单核细胞等免疫细胞表面的LPS受体蛋白结合，刺激免疫细胞的炎症反应通道，继而产生大量的炎症因子，在大量的 LPS 刺激下，机体爆发“瀑布式”的炎症反应综合症，导致一系列的临床症状。 针对这一机制，本实验设计通过提取巨噬细胞膜，将其包裹在Fe3O4纳米粒子表面，形成一种核-壳型的生物仿生型纳米载药系统Fe3O4@MMs，由于继承了巨噬细胞膜的表面性质，Fe3O4@MMs可以在体内外特异性地结合LPS分子，使LPS分子失去毒性作用，从而清除LPS分子。此外Fe3O4作为提供稳定性的基质外还可以适用于磁靶向治疗。最后，在 Fe3O4@MMs 对 LPS 分子清除作用的基础上，我们将抗炎药物穿心莲内酯（andrographolide，AD）负载于细胞膜疏水层中，构成Fe3O4@MMs@AD载药系统。当载药系统清除LPS时，由于LPS对膜层的插膜作用，使得药物快速释放出来，达到联合治疗内毒素所致炎症的目的。 第二章，采用水热法制备正电荷的Fe3O4，差速离心法提取巨噬细胞膜，利用静电作用促进 Fe3O4 与细胞膜的融合，且通过脂质体挤出仪共挤出制备Fe3O4@MMs。并通过负载游离AD构建了Fe3O4@MMs@AD载药系统。电镜和粒径表征显示膜包被的纳米载药系统 Fe3O4@MMs 的构建成功，具有明显的核-壳型结构，粒径大小约为110 nm，表面电位与细胞膜电位相同，为-18 mV左右。AD的负载考察显示，投药量为10%、反应温度为37℃时，AD包封率和载药量最大，分别为84%和7.2%。体外释放研究表明当LPS存在时，可促进药物的快速定位释放。 第三章，通过体外实验来验证纳米载药系统的生物安全性和药效作用。体外细胞毒性实验显示Fe3O4@MMs载体无细胞毒性，具有良好的生物相容性。体外吸附实验结果表明，在37℃下反应90 min，Fe3O4@MMs能有效降低溶液体系中的 LPS 浓度。通过细胞实验验证了游离 AD、Fe3O4@MMs 载体以及Fe3O4@MMs@AD联合治疗对LPS的解毒作用。细胞实验结果显示Fe3O4@MMs能有效抑制LPS所致细胞死亡率，减少细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）的产生，且Fe3O4@MMs@AD联合治疗效果更显著。 第四章，构建内毒素血症小鼠模型，确定 LPS 的注射剂量。动物实验结果显示，通过 Fe3O4@MMs@AD 的治疗，内毒素小鼠血清炎症因子白介素 6 （interleukin 6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等水平能有效降低，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）浓度接近正常水平，体内实验表明 Fe3O4@MMs@AD 联合治疗组的治疗效果要优于 AD 和 Fe3O4@MMs 单独治疗。组织分布研究表明Fe3O4@MMs主要富集于肝、肺组织。肝、肺组织切片结果表明Fe3O4@MMs@AD组小鼠的组织损伤明显好转。且小鼠死亡率能有效降低。

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