中药新穿心莲内酯抗中暑内毒素血症作用机制的研究

摘要

目的：本研究通过建立中暑内毒素血症动物模型，从新穿心莲内酯治疗中暑的药效学实验入手，观察它对中暑内毒素血症的治疗效果；并建立中暑内毒素血症的细胞模型，探讨新穿心莲内酯对中暑内毒素血症的作用及其可能的信号转导机制，为其在防治中暑内毒素血症中的应用奠定理论基础。 方法：实验分为两个部分。第一部分：新穿心莲内酯在中暑内毒素血症小鼠中的作用。昆明小鼠随机分为高温组、生理盐水组、地塞米松组、DMSO（二甲基亚砜组和新穿心莲内酯组（按小鼠体重腹腔注射给药），新穿心莲内酯组按5mg/kg体重腹腔注射给药，地塞米松组按5mg/kg体重腹腔注射给药，生理盐水组给予剂量同新穿心莲内酯组。第二部分：新穿心莲内酯抗中暑内毒素血症信号转导机制的研究。本课题模拟动物中暑内毒素血症模型，从离体细胞实验进一步探讨新穿心莲内酯治疗中暑的作用机制。选用小鼠来源的单核巨噬细胞系RAW264.7细胞做为主要研究对象，以内毒素（终浓度0.1μg/ml）作为主要刺激因素建立内毒素血症模型。 结果：第一部分：新穿心莲内酯在中暑内毒素血症小鼠中的作用。 1.应用新穿心莲内酯后中暑小鼠生理指标变化①各组小鼠肛温上升速率的变化：新穿心莲内酯组5mg/kg组和穿心莲内酯组（5mg/kg）肛温上升速率低于DMSO对照组、地塞米松组、生理盐水组和高温对照组（P<0.05），数据分别为：0.044±0.001℃/min、0.043±0.001℃/min、0.066±0.004℃/min、0.057±0.003℃/min、0.052±0.001℃/min、0.055±0.003℃/min，差异具有统计学意义（P<0.05）；②各组小鼠生存时间的变化：新穿心莲内酯5mg/kg组和穿心莲内酯组（5mg/kg）生存时间明显长于DMSO对照组、地塞米松组、生理盐水组和高温对照组（P<0.05），数据分别为：120.0±3.71min、112.5±4.28 min、87.8±3.89min、92.1±6.10 min、95.8±4.59 min、97±3.22 min；且新穿心莲内酯5mg/kg组的生存时间长于穿心莲内酯组，其差异具有统计学意义P<0.05。 2.血浆中内毒素含量变化热暴露2h后，地塞米松组、生理盐水组和高温对组小鼠血浆内毒素含量分别为0.210±0.008ng/ml0.234±0.013ng/ml和0.259±0.014ng/ml，较正常对照组0.104±0.004ng/ml明显升高（P<0.05）；新穿心莲内酯组小鼠血浆内毒素含量为0.132±0.003ng/ml，略高于正常对照组，二者无统计学意义（P>0.05）。 3.病理组织切片观察①大体标本观察：对照组肺组织颜色均匀，呈粉红色，柔软，弹性好。高温对照组肺脏体积增大，可见弥漫和大片的出血和实变区。新穿心莲内酯组5mg/kg组肺组织出血较高温对照组明显减轻。光镜观察：对照组肺组织结构清楚，肺泡内无白细胞和红细胞浸润，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液。高温对照组肺泡间隔增厚，中性粒细胞浸润，部分肺泡结构破坏，肺内大量中性粒细胞浸润伴出血、水肿。新穿心莲内酯（5mg/kg）组肺泡结构存在，肺泡间隔增厚及中性粒细胞浸润明显减轻，肺间质见渗出液和少量红细胞，肺泡腔可见少量红细胞；②肝组织光镜照片观察到，高温对照组、地塞米松组和生理盐水组肝组织大量充血，中央静脉扩张，可见大量空泡；而新穿心莲内酯（5mg/kg）组肝组织仅见少量的充血和胞核肿胀，未见空泡，与正常对照组相近。 第二部分：新穿心莲内酯拮抗中暑内毒素血症机制的研究。 1.MTT法检测细胞生存活力的变化（以下各组均将正常对照组的生存率定为100%）①给予LPS（浓度为分别为0.1、1、10、20、40μg/ml）培养24h后，其中0.1μg/ml组细胞存活力为33.57±7.17%，1、10、20、40μg/ml组的生存活力分别为37.23±8.24%、42.39±10.5%、43.23±5.25%、51.20±15.7%，其中0.1pg/ml与正常对照组和其他浓度组比均低，具有统计学差异（P<0.05）；②给予新穿心莲内酯（浓度分别为3.0、4.5、7.5、11.25、15、30、60μmol/L）培养24h后，生存力分别为112.5±6.55%、125.1±7.21%、132.9±8.89%、143.6±5.75%、113±4.44%、102.7±4.77%、42.66±8.936%，可以看出，当药物浓度大于60μmol/L的时候，对细胞的生长有明显的抑制作用，在浓度小于60μmol/L的时候，药物对细胞没有毒性作用，而其中当新穿心莲内酯浓度为11.25μmol/L时，对细胞的保护作用最显著；③根据以上结果，确定细胞实验中，LPS的终浓度为0.1μg/ml，新穿心莲内酯的有效保护浓度设定为3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L。细胞在LPS终浓度为0.1μg/ml的培养基中培养4h后，分别分组加入新穿心莲内酯3.0、4.5、7.5、11.25、15、30μmol/L，培养24h后，生存力分别为61.28±1.25%、73.25±1.95%、84.71±3.74%、88.93±6.52%、72.77±2.15%、69.8±1.85%，内毒素对照组存活力为50.06±0.87%。可以看出，当新穿心莲内酯浓度为11.25μmol/L时，对细胞保护能力最强，且有统计学差异（P<0.05）。因此选择3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L五个有效浓度用于下一步实验。 2.信号转导分子TLR4 mRNA表达变化①细胞在内毒素终浓度分别为0、0.1、1、10μg/ml的条件下培养24h后，TLR4 mRNA的表达量各不相同。其中0.1μg/ml组的表达量最高，与其他组比有明显差异，且具有统计学意义（P<0.05）；②细胞在新穿心莲内酯终浓度分别为0、3.0、7.5、11.25μmol/L的条件下培养24h后，TLR4 mRNA的表达量各不相同。其中11.25μmol/L组的表达量明显低于其他组，且具有统计学意义（P<0.05）；③在内毒素终浓度为0.1μg/ml的条件下培养4h后加入新穿心莲内酯（3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L）培养24hTLR4 mRNA的表达量各不相同，与内毒素0.1μg/ml组相比，新穿心莲内酯11.25μmol/L明显抑制了TLR4 mRNA的表达，且具有统计学差异。 3.信号转导分子NF-KB（p50）mRNA的表达变化①细胞在内毒素终浓度分别为0、0.1、1、10μg/ml的条件下培养24h后，NF-KB（p50）mRNA的表达量各不相同。其中0.1μg/ml组的表达量最高，与其他组比有明显差异，且具有统计学意义（P<0.05）；②细胞在新穿心莲内酯终浓度分别为0、3.0、7.5、11.25μmol/L的条件下培养24h后，NF-KB（p50）mRNA的表达量各不相同。其中11.25μmol/L组的表达量明显低于其他组，且具有统计学意义（P<0.05）；③在内毒素终浓度为0.1μg/ml的条件下培养4h后加入新穿心莲内酯（3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L）培养24hNF-KB（p50）mRNA的表达量各不相同，与内毒素0.1μg/ml组相比，新穿心莲内酯11.25μmol/L明显抑制了NF-KB（p50）mRNA的表达，且具有统计学差异（P<0.05）。 4.细胞因子TNF-α表达的变化在内毒素终浓度为0.1μg/ml的条件下培养4h后加入新穿心莲内酯（3.0、7.5、11.25、15、30μmol/L）再培养24h后细胞悬液中TNF-α的表达量各不相同，与内毒素0.1μg/ml组相比，新穿心莲内酯11.25μmol/L明显减少了细胞悬液中TNF-α含量，且具有统计学差异（P<0.05）。 结论: 1.新穿心莲内酯是一种治疗中暑内毒素血症的有效药物，它能减缓中暑小鼠肛温上升速率、延长生存时间；并能够显著降低中暑小鼠血中内毒素含量，同时减轻肝脏、肺脏等重要脏器病理损伤，对中暑小鼠机体具有良好的保护作用。 2.RAW264.7细胞在不同浓度的内毒素培养条件下，细胞信号转导分子TLR4mRNA、NF-KB mRNA的表达量不同，均较正常组升高。但在新穿心莲内酯的作用下，上述俩种因子mRNA的表达明显下降。说明新穿心莲内酯可以有效的抑制由于内毒素引起的TLR4 mRNA、NF-KB mRNA的表达上调。这是此药物发挥生物学效应的重要机制。 3.RAW264.7细胞在不同浓度的内毒素培养条件下，细胞信号转导分子TNF-α的表达量不同，均较正常组升高。但在新穿心莲内酯的作用下，TNF-α的表达量明显下降。说明新穿心莲内酯可以有效的抑制由于内毒素引起的TNF-α的表达量上调。这是此药物发挥生物学效应的重要机制。这可能和新穿心莲内酯抑制了细胞转导通路的上游分子TLR4，中游重要的信号转导分子NF-KB有关。 4.运用AO/EB荧光双重染色法，Hoechst荧光染色法和流式细胞术三种方法对RAW264.7细胞凋亡情况进行了研究。结果同样显示新穿心莲内酯可以明显减少由内毒素引起的细胞调亡。 5.中药新穿心莲内酯多途径多环节多靶点拮抗中暑内毒素血症的作用为该类药物的临床应用打下坚实的理论基础，并为重症内毒素血症的治疗另辟蹊径。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分新穿心莲内酯在中暑内毒素血症小鼠中的作用

实验目的

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分新穿心莲内酯抗中暑内毒素血症信号转导机制的研究

实验目的

材料

主要仪器设备

方法

结 果

1.正常培养的RAW264.7细胞

2. AO/EB荧光双重染色和Hoechst荧光染色法正常培养的RAW264.7细胞

3.新穿心莲内酯对内毒素影响下RAW264.7细胞存活率的影响

4.新穿心莲内酯对内毒素作用下RAW264.7细胞TLR4和NF-KB mRNA表达的影响

5.细胞悬液中细胞因子TNF-α含量的变化

6.新穿心莲内酯对内毒素作用下RAW264.7细胞凋亡的影响

讨论

1.TLR4及其相关因子的作用

2.NF-κB及其相关因子的作用

3.TNF-α对人体的作用

结 语

参考文献

附 录:中英文对照缩略词表

攻读硕士学位期间成果

致 谢

统计学证明