泰国葡萄糖酸杆菌木糖醇脱氢酶与乙醇脱氢酶基因的克隆表达及木糖醇的全细胞法生物合成

摘要

木糖醇是一种重要的化学品，广泛应用于食品和制药行业。由于其巨大的工业价值，木糖醇已被美国能源部（DOE）列为12种重要的高附加值化学品之一。近年来，随着人们对环保和“绿色”生产的日益关注，D-阿拉伯醇生物转化生产木糖醇已成为国内外研究的热点。木糖醇脱氢酶（XDH）是一种NADH依赖型的酶，在 D-阿拉伯糖醇生物转化为木糖醇的过程中起着关键作用；另外乙醇脱氢酶（ADH）在该转化过程中有助于辅酶NADH的再生，从而促进木糖醇的生物合成。因此，本文构建木糖醇脱氢酶工程菌株，以及 NADH 辅酶再生系统，从而促进木糖醇的生物合成。本论文取得的主要结果如下： （1）使用PCR技术从泰国葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter thailandicus）中克隆了编码XDH的编码基因xdh，成功构建了重组质粒pET-xdh，使其在Escherichia coli BL21（DE3）中实现了表达。重组菌BL21-xdh SDS-PAGE电泳显示，有大小约33 kDa特异性蛋白条带出现。重组酶XDH纯化后，测定并分析其酶学性质。将木酮糖作为底物时，重组酶XDH还原反应的最佳反应温度为30℃，最佳pH约为6.0，还原反应的比活力为50.2 U/mg；对木酮糖的Km值为20.7 mM，Vmax为132.8 U/mg；对木酮糖的Km值为20.7 mM，Vmax为132.8 U/mg。而将木糖醇作为底物时，重组酶XDH氧化反应的最佳温度为35℃，最佳pH约为9.0，氧化反应的比活为16.6 U/mg；对木糖醇的Km值为63.3 mM，Vmax为98.6 U/mg。以NADH为底物的Km值为4.2mM，Vmax为55.6 U/mg；以NAD+为底物的Km值为14.1mM，Vmax为39.0 U/mg。 （2）克隆表达了G. thailandicus的adh基因，成功构建了重组质粒pET-adh，并使其在E. coli BL21(DE3)中实现表达，重组菌BL21-adh SDS-PAGE电泳显示,重组酶 ADH的蛋白分子量约为19 kDa。结果表明以乙醇为底物时，重组ADH最适反应pH值为8.0，最适反应温度为40℃。重组ADH的底物特异性分析显示，以乙醇为底物时，重组ADH的比活力最高，为45.8 U/mg。 （3）优化了在全细胞混合转化过程中影响木糖醇产量的关键因素，优化后条件为：D-阿拉伯糖醇浓度40 g/L，乙醇浓度2%，G. thailandicus、BL21-xdh和BL21-adh的质量比为1.5:1:1，最适转化温度为35℃。 （4）在优化条件下，G. thailandicus、BL21-xdh和BL21-adh三菌全细胞混合转化48h时，木糖醇产量为34.34 g/L，在36h时底物D-阿拉伯糖醇转化为产物木糖醇的转化率最高，为0.86 g/g。与原始菌G. thailandicus相比，木糖醇产量提高了近2.7倍；G. thailandicus和BL21-xdh的两菌全细胞混合转化48h时得到最高产量为32.80 g/L，在36h时底物D-阿拉伯糖醇转化为产物木糖醇的转化率最高，为0.82 g/g。与原始菌G. thailandicus相比，木糖醇产量提高了近2.6倍；三菌全细胞混合转化相较于两菌的全细胞混合转化，产量提高了4.70%。 本研究通过多菌混合生物转化合成木糖醇，无需添加外源 NADH。研究结果为木糖醇的生物合成提供了参考。

目录

第一个书签之前