华根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶的基因克隆、表达，纯化和酶学性质研究

摘要

生物催化在工业应用的过程中，一个很大的限制因素就是催化剂脂肪酶。自然条件下，菌株产脂肪酶量较低，利用常规育种方法难以满足工业化生产的需要。本论文从华根霉(Rhizopuschinensis)CCTCCM201021中首次克隆得到其脂肪酶全基因，并实现了华根霉脂肪酶前导肽和成熟肽在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中的高水平分泌表达，初步分离纯化后对比了两重组脂肪酶的酶学性质差异，为华根霉脂肪酶的进一步理论研究及其应用奠定了基础。主要研究结果包括： (1)以实验室保藏菌种华根霉基因组为模板，利用根霉通用引物PCR扩增得到华根霉18SrDNA片段，鉴定其种属。根据Rhizopusstolonifer和Rhizopusoryzae脂肪酶基因序列比对后设计调取华根霉脂肪酶基因的引物，利用两次PCR程序分别获得华根霉脂肪酶上、下游片段，拼接后得到华根霉脂肪酶全基因(RCL)。该基因的开放阅读框长1170bp，不含内含子，编码一个389个氨基酸残基的蛋白质。包括26个氨基酸的信号肽，94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽，其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86％。 (2)构建酵母分泌型表达重组质粒pPIC9k-proRCL和pPIC9k-mRCL，将重组表达质粒线性化后电转化巴斯德毕赤酵母。构建了GS115/pPIC9k-proRCL用于分泌表达前导肽脂肪酶，表型包括His+Muts和His+Mut+；构建了GS115/pPIC9k-mRCL用于分泌表达成熟肽脂肪酶，表型包括His+mats和His+mut+。SDS-PAGE分析表达的慢生型前肽脂肪酶的分子量为37kD左右，最大分泌表达量为0.85mg/mL，占分泌蛋白总量的68.3％，pNPP法测得此时的脂肪酶水解活力为121.2U/mL;表达的慢生型成熟肽脂肪酶的分子量为30kD左右，最大分泌表达量为0.16mg/mL，占分泌蛋白总量的21.6％，pNPP法测得此时的脂肪酶水解活力为4.3U/mL。 (3)将重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9k-proRCLMuts和GS115/pPIC9k-mRCLMuuts发酵上清液经过10KD超滤膜浓缩，SP-SepharoseFF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose6FF疏水色谱柱层析后得到脂肪酶活性组分proRCL和mRCL。纯化后的重组蛋白proRCLN-端氨基酸测序分析表明该重组脂肪酶是加工过的产物，分泌表达的重组脂肪酶只保留了前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸，简称pr027RCL。酵母菌GS115/pPIC9k-pr027RCL和GS115/pPIC9k-mRCL的表达上清液在用EndoH处理前与处理后其蛋白分子量没有发生变化，表明该酵母表达的重组脂肪酶都未进行N端糖基化修饰。 (4)通过对重组脂肪酶pr027RCL和mRCL的酶学性质研究，发现pro27RCL和mRCL的最适反应pH和最适反应温度相近，最适pH值分别为8.5和8.0，最适反应温度分别为40℃和35℃。但底物选择性和动力学常数差异较大。pro27RCL对C6-C8中链脂肪酸酯水解活力较高，而mRCL对pNPC2的水解活力最高，对C2-C6的短链脂肪酸酯水解活力较高，分类学上更倾向于酯酶(EsteraseE.C.3.1.1.2)。两脂肪酶对对硝基苯酚棕榈酸酯的Km和Vmax分别为0.304mmol/L、0.345mmol/L和3.38μmol/min/mL、0.074μmol/min/mL。pro27RCL，和mRCL对三油酸甘油酯均没有位置选择性。10mmol/L的Ca2+、Mg2+对两重组脂肪酶均有较好的激活作用，而Hg2+、SDS和PMSF强烈抑制两酶的活力。它们在正己烷、正庚烷和异辛烷(30％v/v)中具有较高的活力和良好的稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1立题意义

1.2国内外研究进展

1.2.1脂肪酶重组菌的研究现状

1.2.2巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

1.2.3根霉脂肪酶的纯化及立体结构

1.2.4根霉脂肪酶的应用

1.3本课题研究思路和内容

1.3.1课题研究思路

1.3.2研究方法

1.3.3研究内容

第二章华根霉脂肪酶基因的克隆和序列分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1菌株与质粒

2.2.2主要试剂

2.2.3培养基与溶液

2.2.4主要仪器

2.2.5实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1华根霉基因组DNA的获得

2.3.2华根霉18S rDNA PCR扩增产物的电泳鉴定

2.3.3克隆质粒的构建

2.3.4华根霉18S rDNA基因序列及其系统进化树

2.3.5 RCL基因序列的获得

2.3.6克隆质粒的构建

2.3.7 RCL全基因序列及其蛋白序列

2.3.8 RCL模拟三维结构分析

2.4本章小结

第三章表达质粒的构建和在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1菌株与质粒

3.2.2主要试剂

3.2.3培养基与溶液

3.2.4主要仪器

3.2.5实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1前导序列proRCL和成熟脂肪酶mRCL基因的克隆

3.3.2 pPIC9k-proRCL和pPIC9k-mRCL表达质粒的构建与鉴定

3.3.3脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

3.4讨论

3.5本章小结

第四章重组蛋白的分离纯化

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1菌株

4.2.2主要试剂

4.2.3培养基与溶液

4.2.4主要仪器

4.2.5实验方法

4.3结果与分析

4.3.1脂肪酶的分离纯化

4.3.2酶的分子量

4.3.3重组脂肪酶proRCL和mRCL的分离纯化结果

4.3.4重组脂肪酶proRCL N-端氨基酸序列分析

4.4本章小结

第五章重组脂肪酶酶学性质研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1实验材料

5.2.2实验方法

5.3结果与讨论

5.3.1 pH对重组脂肪酶活力的影响

5.3.2 pH对重组脂肪酶稳定性的影响

5.3.3温度对重组脂肪酶活力的影响

5.3.4温度对重组脂肪酶稳定性的影响

5.3.5重组脂肪酶的脂肪酸链长专一性

5.3.6重组脂肪酶的位置选择性

5.3.7不同化合物对重组脂肪酶活力的影响

5.3.8重组脂肪酶的有机溶剂稳定性

5.3.9重组脂肪酶的动力学常数

5.3.10 N-端糖基化分析

5.4本章小结

主要结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文清单