乳铁蛋白抗菌肽的制备及分离纯化

摘要

乳铁蛋白是牛初乳中的一种生物活性蛋白，具有广谱抗菌、增强铁的传递与吸收、免疫调节、抗病毒等作用，但是其热稳定性很差，限制了其应用范围。将其酶解不仅可以提高抑菌活性，还可以增强热稳定性，这将拓宽它在食品、医药、饲料等行业的应用。本课题对天然抗菌剂的开发具有重要意义。本论文主要研究了制备乳铁蛋白抗菌肽的酶解工艺、脱盐工艺和分离纯化，并对此抗菌肽进行了抑菌性研究。 首先，研究了乳铁蛋白抗菌肽的酶解工艺。通过单因素试验，响应面回归分析得到酶解的最佳工艺为：采用胃蛋白酶为酶源，乳铁蛋白浓度为30mg/mL，胃蛋白酶与乳铁蛋白的质量比为1.5％，温度44℃，pH2.4，水解时间2h。优化条件下水解度为10.76％，抑菌率为97.97％。乳铁蛋白抗菌肽氨基酸组成分析显示，其中疏水性氨基酸占32.90％，碱性氨基酸占19.15％。高效液相体积排阻分析发现，乳铁蛋白抗菌肽的相对分子质量主要分布在200～6000左右。 其次，研究了DA201—C大孔吸附树脂对乳铁蛋白抗菌肽静态及动态脱盐作用。通过静态吸附实验，得到了吸附的动力学曲线及方程、吸附等温线和最佳洗脱剂。对于上样浓度为10mg/mL的乳铁蛋白抗菌肽，吸附速率方程为Y=0，5035X—0.3971(R2=0.9045)；上样浓度为30mg/mL时，吸附速率方程为Y=0.4887X+1.0815(R2=0.9412)。平衡吸附量方程为：Qe=1.7461C—+0.5703(R2=0.9993)。最佳的洗脱剂为85％乙醇。动态吸附实验结果表明：在采用85％乙醇为洗脱剂时，DA201—C大孔吸附树脂对乳铁蛋白抗菌肽的脱盐率为97.40％，乳铁蛋白抗菌肽的回收率为92.54％。对乳铁蛋白抗菌肽的稳定性研究发现，其具有较强的耐肠道酶消化稳定性；在酸性条件下，具有较强的热稳定性和贮藏稳定性。 最后，研究了乳铁蛋白抗菌肽的分离纯化。首先通过SephadexG—50分离得到了抗菌性更强的乳铁蛋白抗菌肽—b，该肽在1mg/mL时，对大肠杆菌的抑菌率为99.17％。然后通过半制备RP—HPLC进一步分离得到的乳铁蛋白抗菌肽—b1，它在0.1mg/mL时对大肠杆菌的抑菌率为99,05％。进一步通过分析型RP—HPLC纯化，得到了乳铁蛋白抗菌肽—b1-1，图谱显示为单一峰。在0.1mg/mL时对大肠杆菌的抑菌率为99.12％，其相对分子质量为2500左右。研究结果还表明，该抗菌肽可以抑制包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等常见的食品腐败菌及致病菌，具有广谱抗菌性。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1生物活性肽

1.2抗菌肽

1.2.1抗菌肽的分类与结构

1.2.2抗菌肽的抗菌机理

1.2.3抗菌肽的研究开发现状

1.2.4抗菌肽研究面临的问题

1.3乳铁蛋白

1.3.1乳铁蛋白的结构

1.3.2乳铁蛋白的生物活性及应用展望

1.4乳铁蛋白抗菌肽的研究现状

1.5立题背景和意义

1.6论文的主要研究内容

第二章乳铁蛋白酶解工艺

2.1前言

2.2实验材料和设备

2.2.1实验材料

2.2.2主要仪器

2.3实验方法

2.3.1乳铁蛋白酶解工艺

2.3.2蛋白酶活力测定

2.3.3蛋白质水解度的测定

2.3.4大肠杆菌菌浓-吸光度标准曲线

2.3.5抑菌性的测定

2.3.6氨基酸组成分析

2.3.7相对分子量分布的测定

2.3.8数据统计及分析

2.4结果与讨论

2.4.1不同蛋白酶对乳铁蛋白的酶解能力

2.4.2酶源对制备乳铁蛋白抗菌肽的影响

2.4.3温度对水解度的影响

2.4.4底物浓度对水解度的影响

2.4.5酶与底物浓度比对水解度的影响

2.4.6 pH对水解度的影响

2.4.7工艺优化

2.4.8优化条件下的水解进程曲线及其抑菌性

2.4.9乳铁蛋白及其酶解产物中的氨基酸分析

2.4.10乳铁蛋白酶解产物的相对分子量分布

2.5本章小结

第三章乳铁蛋白抗菌肽的脱盐工艺

3.1前言

3.2实验材料和设备

3.2.1实验材料

3.2.2主要仪器

3.3实验方法

3.3.1乳铁蛋白抗菌肽的制备

3.3.2大孔吸附树脂的预处理

3.3.3大孔吸附树脂的静态吸附试验

3.3.4多肽浓度的测定

3.3.5大孔吸附树脂的静态吸附动力学分析

3.3.6大孔吸附树脂的静态吸附等温线

3.3.7大孔吸附树脂的静态解吸试验

3.3.8大孔吸附树脂的动态解吸试验

3.3.9抑菌性的测定

3.3.10灰份的测定

3.3.11乳铁蛋白抗菌肽的稳定性的测定

3.4结果与讨论

3.4.1大孔吸附树脂的选择

3.4.2 DA-201C大孔吸附树脂吸附前后吸收光谱变化

3.4.3 DA201-C大孔吸附树脂的吸附动力学特征

3.4.4 DA201-C大孔吸附树脂的平衡吸附量

3.4.5乳铁蛋白抗菌肽的静态解吸

3.4.6乳铁蛋白抗菌肽的动态脱盐

3.4.7乳铁蛋白抗菌肽的稳定性

3.5本章小结

第四章乳铁蛋白抗菌肽的分离纯化

4.1前言

4.2实验材料和设备

4.2.1实验材料

4.2.2主要仪器

4.3实验方法

4.3.1脱盐乳铁蛋白抗菌肽的制备

4.3.2抑菌性的测定

4.3.3乳铁蛋白抗菌肽的凝胶过滤色谱分离

4.3.4半制备RP-HPLC分离乳铁蛋白抗菌肽

4.3.5分析型RP-HPLC纯化乳铁蛋白抗菌肽

4.3.6相对分子质量的测定

4.4结果与讨论

4.4.1乳铁蛋白抗菌肽的凝胶过滤色谱分离

4.4.2经凝胶色谱分离后不同组分对大肠杆菌的抑制活性

4.4.3半制备RP-HPLC分离乳铁蛋白抗菌肽-b

4.4.4分析型RP-HPLC纯化乳铁蛋白抗菌肽-b1

4.4.5乳铁蛋白抗菌肽的抑菌活性的研究

4.5本章小结

主要结论

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文