发酵法生产十五碳二元酸

摘要

麝香是药中珍品，又是一种极为重要的香料。天然麝香量少价高，主要成分为3-甲基环十五酮(人工麝香)，以十五碳二元酸(DCA15)为原料通过化学合成可得到人工麝香，得率高、成本相对较低，可大量生产，并可替代天然麝香。因此研究开发高纯度DCA15的发酵生产技术具有现实意义。 本论文对DCA15生产菌株——热带假丝酵母(Candidatropicalis)进行了选育，研究其摇瓶发酵条件和发酵技术，通过代谢调控，进一步强化α,ω氧化能力、弱化β氧化能力，并对DCA15提取纯化工艺进行研究。 以C.tropicalis072为出发菌株，经紫外线、亚硝酸诱变和氯丙嗪平板筛选，筛选得到一株遗传特性稳定的DCA15生产菌株Ctropicalis410，DCA15产量达17.50g/L，烷烃转化率达29.63％，DCA15产量和烷烃转化率均比出发菌株提高45％。 对Ctropicalis410生产DCA15的摇瓶发酵条件及发酵培养基进行优化。确定其摇瓶发酵条件：挡板三角瓶(250mL)，装液量25mL/250mL，转速180r/min，接种量8％(v/v)。在单因素试验基础上，利用均匀设计法，并借助MATLAB7.1对数据进行统计分析，得到发酵培养基：尿素0.5g/L、乙酸钠3.7g/L、KH2PO49.1g/L、酵母膏1g/L、玉米浆粉1g/L、NaCl1g/L。在此优化条件下，DCA15产量达29.32g/L，比初始条件下提高了67.5％；转化率达35.46％，比初始条件下提高16.44％。 对C.tropicalis410生产DCA15进行代谢调控。考察α,ω氧化促进剂、β氧化抑制剂对发酵的影响，初步探索生长代谢与产物合成代谢的关系。最后确定，12h添加0.5g/Lα,ω氧化促进剂——苯巴比妥，24h添加2g/Lβ氧化抑制剂——丙烯酸，48h添加10g/L蔗糖，DCA15产量达38.82g/L，比初始条件下提高32.40％，转化率达41.08％，比初始条件下提高15.80％。并在7L罐上确定pH梯度上升调控策略，即从第24h开始，每隔12hpH上调0.1。 优化DCA15提取纯化条件：破乳静置发酵液pH7，添加10g/L活性炭及1.5％H2O2除色除菌体蛋白，60℃，pH9.0水洗涤活性炭滤饼，将发酵液加热到80℃后再调pH2～3结晶。采用优化后的提取工艺，DCA15得率达96％，纯度达95％以上

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论文说明：缩略词注释表

声明

第一章绪论

1.1引言

1.2十五碳二元酸理化性质及应用

1.2.1十五碳二元酸理化性质

1.2.2十五碳二元酸应用

1.3十五碳二元酸生产方法

1.3.1植物油裂解制取十五碳二元酸

1.3.2微生物发酵法生产十五碳二元酸

1.4十五碳二元酸国内外研究进展

1.4.1长链二元酸生产菌种

1.4.2代谢途径及相关酶系

1.4.3发酵技术

1.4.4产物提取纯化

1.5立题背景及意义

1.6本课题主要研究内容

第二章十五碳二元酸生产菌株的选育

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1主要试剂和仪器

2.2.2菌种来源

2.2.3培养基

2.2.4实验方法

2.2.5分析测定方法

2.3结果与讨论

2.3.1出发菌株的生长曲线

2.3.2诱变剂量的确定

2.3.3变异菌株的获得

2.3.4氯丙嗪平板筛选

2.3.5 Candida tropicalis 410的遗传稳定性

2.4小结

第三章Candida tropicalis 410生产十五碳二元酸发酵条件的优化

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1主要试剂和仪器

3.2.2菌种来源

3.2.3培养基

3.2.4分析测定方法

3.2.5实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1摇瓶发酵条件的确定

3.3.2碳源对十五碳二元酸发酵的影响

3.3.3无机氮源对十五碳二元酸发酵的影响

3.3.4有机氮源对十五碳二元酸发酵的影响

3.3.5 KH2PO4对十五碳二元酸发酵的影响

3.3.6均匀设计法优化发酵培养基

3.4小结

第四章Candida tropicalis 410生产十五碳二元酸代谢调控的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1主要试剂和仪器

4.2.2菌种来源

4.2.3培养基

4.2.4分析测定方法

4.3结果与讨论

4.3.1α、ω氧化的强化

4.3.2 β氧化的弱化

4.3.3 pH调控及7 L罐放大试验

4.4本章小结

第五章十五碳二元酸的提取与纯化

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1主要试剂和仪器

5.2.2分析测定方法

5.3结果与讨论

5.3.1产物提取纯化工艺的优化

5.3.2红外光谱法鉴定产物

5.3.3 HPLC法测定产物纯度

5.4小结

第六章主要结论与展望

6.1主要结论

6.2展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文