竹黄菌发酵产竹红菌素的研究

摘要

竹黄是我国民间药用真菌，其主要生物活性成分为竹红菌素。本文筛选到一株产竹红菌素的竹黄菌株并对其进行了鉴定，然后围绕其色素组成成分鉴定、固态发酵产色素条件和产色素的生理特征展开了研究，得到了如下主要结果：
　　 1)采用PDA平板筛选到一株产竹红菌素的竹黄菌株，命名为SUPER-H168。通过分子生物学鉴定，确认该菌株隶属于竹黄属(Shiraia)。rDNA聚类分析表明，该菌株与GenBank中已经提交的竹黄菌(Shiraia bambusicola)序列相似度分别为91%(18S rDNA)和88%(ITS-5.8S rDNA)。在无性世代的菌丝上发现了较小的分生孢子器(3～5μm×10～20μm)和分生孢子(一般<1μm)，之前的文献中未曾有报道。对发酵菌丝的组成成分研究表明，其营养组分与子座差异较大，但竹红菌素含量接近。
　　 2)利用制备反相高效液相色谱法，对竹黄菌株SUPER-H168固态条件下所产的色素进行了分离，发现固态发酵条件下所获得的色素有6个主要组分，采用NMR(1H NMR及13C NMR)及质谱法对其中的4种组分进行了鉴定。结果表明，这4种组分分别为竹红菌甲素(HA)、竹红菌乙素(HB)、竹红菌丙素(HC)和痂囊腔菌素C(EC)。其中EC为首次从竹黄中分离到。
　　 3)竹黄菌株SUPER-H168生长需要较充足的营养条件，在营养贫乏的固态基质(如米糠、甘蔗渣、锯末、竹屑、秸秆、橘皮和玉米芯等)上几乎不生长。色素产生需要合适的基质，主要是淀粉含量高的一些谷物(如大米、小米、小麦、黑米、玉米、高粱和荞麦等)及某些副产品(如麸皮)。利用大豆及豆粕作为基质时，菌体生长良好，但无色素生成。色素的产生与基质的淀粉/蛋白比值(S/P)有很大关系，只有当S/P大于1.4时才会产生色素。此外，色素各组分百分含量还受到发酵基质的影响，其中HA是色素的主要组分(通常超过40%)，以小米和高粱为基质时菌株不产HB。研究表明，发酵基质中淀粉酶活力和蛋白酶活力均比较低。淀粉酶活力和还原糖含量变化非常一致，在一定时间内可以反映菌体量的变化。但两种酶与菌体产色素无直接关系。
　　 4)以玉米渣作为固态发酵基质，采用250 mL三角瓶进行固态发酵实验。首先通过单因素法对固态基质产色素条件进行了初步优化，然后通过响应面设计对培养基进一步优化，最后获得的优化培养基为：玉米渣(粒径1.0～1，2 mm)25 g、麸皮5g、初始含水量50%、初始pH7.0，NaNO30.261g、ZnSO4·7H2O0.054 g、葡萄糖1.5 g，培养温度30℃，相对湿度为80%～90%，发酵周期18 d。在此条件下色素产量为14.08 mg/g干基，约为优化前的2倍。实验还发现氮源的种类和添加量对色素的产生有着极为明显的影响。在一定范围内，无机氮源中的NaNO3及有机氮源中的牛肉膏、酵母膏有利于色素的产生，而无机氮源中的尿素和某些铵盐((NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3等)及有机氮源中蛋白胨对色素的合成具有强烈抑制作用。金属离子对色素的合成也有一定影响：Zn2+、Na+及K+利于色素产生，Mn2+则有抑制作用。根据固态发酵过程数据，构建了菌体生长、色素合成和底物(残糖)消耗动力学模型。
　　 5)采用液态发酵的方法，对菌体产色素过程中的生理特征进行了研究，发现菌体在产色素时氧化水平较高(丙二醛含量升高)，这表明菌体在产色素时受到了色素的氧化胁迫作用。总抗氧化力变化比较小，说明菌体启动了抗氧化机制维持了胞内及胞外氧化/还原水平的平衡。研究发现，在发酵24 h左右加入终浓度40μmol/L的过氧化氢可以促进色素的产生，一定强度的光照(40μE/m2/s)也可以促进平板培养和液态发酵条件下色素的合成。上述结果说明色素对菌体的氧化胁迫作用可促进色素的分泌，属于一种正反馈机制。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 苝醌类色素

1.1.1 简介

1.1.2 合成途径

1.2 竹黄概述

1.2.1 简介

1.2.2 生物学特性

1.2.3 主要生物活性物质

1.3 竹红菌素

1.3.1 简介

1.3.2 竹红菌素的生理功能

1.3.3 竹红菌素的修饰

1.3.4 竹红菌素的合成

1.3.5 竹红菌素的应用

1.4 本课题的依据与研究内容

第二章 产竹红菌素竹黄菌株的筛选及组成成分分析

2.1 引言

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 材料

2.2.2 实验仪器

2.2.3 化学试剂

2.2.4 培养基

2.2.5 孢子悬液的制备

2.3 方法

2.3.1 菌株的筛选

2.3.2 菌株的生物学特征研究

2.3.3 分子生物学鉴定

2.3.4 色素制备

2.3.5 HA鉴定

2.3.6 发酵菌丝与子座组分比较

2.4 结果

2.4.1 产苝醌类色素菌株的筛选

2.4.2 菌株SUPER-H168的生物学特征

2.4.3 rDNA序列测定及聚类分析

2.4.4 HA鉴定

2.4.5 发酵菌丝组分分析及与子座的比较

2.5 讨论

第三章 竹黄菌株SUPER-H168固态发酵色素成分分离鉴定

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.2.1 材料

3.2.2 实验仪器

3.2.3 化学试剂

3.3 方法

3.3.1 色素提取工艺

3.3.2 色素组分的分离

3.3.3 色素成分的鉴定

3.4 结果

3.4.1 色素提取工艺的确定

3.4.2 RP-HPLC分离图谱

3.4.3 四种化合物的结构式

3.4.4 HA的结构鉴定

3.4.5 HB的结构鉴定

3.4.6 HC的结构鉴定

3.4.7 EC的结构鉴定

3.5 讨论

第四章 基质对竹黄菌株SUPER-H168生长及产色素的影响

4.1 引言

4.2 实验材料与仪器

4.2.1 材料

4.2.2 实验仪器

4.2.3 化学试剂

4.2.4 培养基

4.2.5 孢子悬液的制备

4.3 方法

4.3.1 固态发酵生物量检测方法的比较

4.3.2 固态发酵

4.3.3 淀粉含量测定

4.3.4 粗蛋白含量测定

4.3.5 α-淀粉酶活力测定

4.3.6 蛋白酶活力测定

4.3.7 还原糖含量测定

4.3.8 色素含量测定

4.3.9 HA、HB、HC和EC含量测定

4.3.10 培养基碳源与氮源比值对产色素的影响

4.3.11 数据统计分析

4.4 结果

4.4.1 麦角固醇和D-氨基葡糖随时间变化情况

4.4.2 D-氨基葡糖(吸光值)与菌体量相关曲线

4.4.3 发酵基质对菌体量及色素产量的影响

4.4.4 发酵基质组成对菌体量及色素产量的影响

4.4.5 发酵基质对色素组成的影响

4.4.6 发酵基质对菌丝形态的影响

4.4.7 固态基质对菌体生长和色素生成过程的影响

4.4.8 固态基质对淀粉酶活力及还原糖变化的影响

4.4.9 蛋白酶活力变化

4.4.10 培养基碳源与氮源比值对产色素的影响

4.5 讨论

第五章 竹黄菌株SUPER-H168固态发酵产色素条件优化

5.1 引言

5.2 实验材料与仪器

5.2.1 材料

5.2.2 实验仪器

5.2.3 化学试剂

5.2.4 培养基

5.2.5 孢子悬液的制备

5.3 方法

5.3.1 固态发酵培养条件初步优化

5.3.2 响应面实验设计

5.3.3 动力学模型的建立

5.3.4 数据统计分析

5.4 结果

5.4.1 固态发酵培养条件的初步优化

5.4.2 利用响应面法优化固态发酵培养基

5.4.3 竹黄菌固态发酵动力学模型的求解及拟合

5.5 讨论

第六章 竹黄菌株SUPER-H168产色素生理机制研究

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 材料

6.2.2 实验仪器

6.2.3 化学试剂

6.2.4 培养基

6.2.5 孢子悬液的制备

6.3 方法

6.3.1 液态培养

6.3.2 样品的制备

6.3.3 CAT活力测定

6.3.4 SOD活力测定

6.3.5 丙二醛含量测定

6.3.6 生物量测定

6.3.7 氧化还原指标的测定

6.3.8 色素含量测定

6.3.9 胁迫实验

6.3.10 数据统计分析

6.4 结果

6.4.1 发酵过程中色素和生物量的变化

6.4.2 菌丝形态比较

6.4.3 丙二醛含量变化

6.4.4 过氧化氢水平的变化

6.4.5 维生素C含量变化

6.4.6 总抗氧化力水平的变化

6.4.7 CAT活力变化

6.4.8 SOD活力变化

6.4.9 生理指标与产色素之间的多元相关分析

6.4.10 氧化胁迫对产色素的影响

6.5 讨论

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

论文创新点

附录

致谢