云芝液体深层发酵产胃蛋白酶抑制剂的研究

摘要

本文对云芝液体深层发酵产胃蛋白酶抑制剂的发酵条件及其优化、分离纯化、基本特性和应用进行了研究。主要研究内容及结果如下：
　　 ⑴对韩芝、甜芝、赤芝G-8、云芝4株菌进行液体深层发酵，生物量以云芝最高，达12.97 g/L，是韩芝的2.56倍；比较这4种菌株细胞破壁后对胃蛋白酶的抑制效果，仍以云芝发酵组最好，可达25.1 IU/mL；云芝发酵液超声细胞破碎前后对胃蛋白酶的抑制效果显示，破碎后对胃蛋白酶的抑制活力由破碎前的1.09 IU/mL提高到23.9 IU/mL，说明胃蛋白酶抑制剂为云芝胞内产物。
　　 ⑵利用单因素实验，找到云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂主要影响因子为装液量、接种量和起始pH。在此基础上，以马铃薯为培养基，采用正交实验对培养条件进行优化，得最佳培养条件:发酵周期120 h，发酵温度28℃，转速180 r/min，起始pH5.6，装液量70 mL/250mL，接种量12%。优化后抑制剂产量56.5 IU/mL，比优化前提高了2.08倍。
　　 ⑶云芝发酵液经超声细胞破碎，离心和大孔树脂脱色后冻干得粗抑制剂，再经DEAE-52、MonoQ离子交换层析和UltroGelACA-54凝胶过滤后得到纯化的胃蛋白酶抑制剂(命名为CVPPI)，纯化倍数达38.7。经SDS-PAGE与UltroGelACA-54凝胶过滤测定CVPPI是单亚基，相对分子量为22.31 kDa。
　　 ⑷CVPPI的成分为蛋白质，氨基酸组成结果表明:酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的相对含量较高，分别达37.1%和12.4%:活性实验分析表明抑制剂本身不是蛋白酶，也不能被胃蛋白酶水解；最佳抑制反应时间为1小时；热稳定性较好，100℃保温1小时后抑制活性几乎没有任何损失；抑制效果受温度影响不大，10℃～60℃活性基本稳定；pH稳定范围为3.0～7.0。
　　 ⑸CVPPI对胃蛋白酶表现出较高的特异性抑制作用，对蛋白酶A也具有一定的抑制活性；它对胃蛋白酶和蛋白酶A的半抑制浓度IC50值分别约为26.26μg/mL和152.4μg/mL，对二者抑制作用的Ki值分别为0.876μmol/L和2.77μmol/L； CVPPI是胃蛋白酶的非竞争与反竞争混合型抑制剂，是蛋白酶A的非竞争性抑制剂；反应机理表明:CVPPI与胃蛋白酶混合后形成复合物，推测反应机理可能是抑制剂与胃蛋白酶并列相伴，在酶的活性基团形成氢键并封锁酶与底物的结合部位，从而抑制胃酶的活性。
　　 ⑹利用DEAE-52离子交换层析和UltroGelACA-54凝胶过滤从土豆汁中分离得到一种与CVPPI分子量最接近的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(命名为PAPI)，其分子量为18.9 kDa，经验证得到两种抑制剂的分子量、反应机理、成分和特异性均不相同，确定CVPPI与土豆中的抑制剂并不相同。
　　 ⑺对CVPPI进行应用初探得到其对1号和2号商品小麦蛋白水解酶的最佳抑制反应时间为0.5小时；两种小麦蛋白酶酶抑比与抑制率不成线性关系，当抑制率达到50%时，酶抑比分别为10:1和4:1。推测CVPPI可改善小麦的面团流变性和发酵耐力，预期其有在食品添加剂等行业的应用潜力。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 研究背景

1.2 研究现状

1.2.1 云芝深层发酵的研究

1.2.2 蛋白酶抑制剂的研究

1.2.3 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的来源

1.2.4 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的应用

1.2.5 以胃蛋白酶作为天冬氨酸蛋白酶抑制剂筛选靶酶的意义

1.3 立题意义

1.4 本论文主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 主要材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 主要方法

2.2.1 培养方法

2.2.2 不同菌株的生物量比较

2.2.3 不同菌株发酵产胃蛋白酶抑制剂的比较

2.2.4 细胞破碎前后云芝发酵液成分及抑制活性比较

2.2.5 云芝发酵条件的优化

2.2.6 分析测定方法

2.2.7 粗抑制剂的提取

2.2.8 CVPPI的进一步分离纯化

2.2.9 CVPPI的分子量及纯度鉴定

2.2.10 CVPPI的基本性质研究

2.2.11 土豆汁中的天冬氨酸蛋白酶抑制剂(PAPI)与CVPPI的性质比较

2.2.12 小麦蛋白水解酶的粗酶提取

2.2.13 对小麦蛋白水解酶抑制反应时间的确定

2.2.14 小麦蛋白水解酶酶抑比对抑制活性的影响

第三章 结果与讨论

3.1 云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂发酵条件的优化

3.1.1 不同菌株生物量的比较

3.1.2 云芝生长曲线的绘制

3.1.3 不同菌株发酵产胃蛋白酶抑制剂的比较

3.1.4 云芝发酵液细胞破碎前后组分的基本分析

3.1.5 云芝发酵条件的优化

3.2 云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂(CVPPI)的分离纯化

3.2.1 粗抑制剂的提取

3.2.2 CVPPI的进一步纯化

3.2.3 CVPPI的分子量及纯度鉴定

3.3 云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂(CVPPI)的性质研究

3.3.1 CVPPI的氨基酸组成

3.3.2 抑制反应时间对CVPPI抑制活性的影响

3.3.3 CVPPI的温度稳定性

3.3.4 CVPPI的蛋白酶活性及底物属性的分析

3.3.5 CVPPI的pH稳定性

3.3.6 温度对CVPPI抑制活性的影响

3.3.7 CVPPI对不同蛋白酶的抑制特异性

3.3.8 CVPPI对胃蛋白酶的半抑制浓度IC50值的测定

3.3.9 CVPPI对PrA的半抑制浓度IC50值的测定

3.3.10 CVPPI对胃蛋白酶的抑制动力学

3.3.11 CVPPI对PrA的抑制动力学

3.3.12 CVPPI的反应机理探讨

3.3.13 PAPI的分子量确定

3.3.14 PAPI的反应机理

3.3.15 两种蛋白酶抑制剂的比较

3.4 云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂(CVPPI)的应用初探

3.4.1 抑制反应时间对小麦蛋白水解酶的酶活影响

3.4.2 小麦蛋白水解酶酶抑比对抑制活性的影响

结论与展望

1 主要结论

2 展望

致 谢

参考文献

附录