解淀粉芽孢杆菌的选育及产中温α-淀粉酶的研究

摘要

中温α-淀粉酶是一种十分重要的工业用酶，广泛应用于粮食加工、食品、酿造、发酵、纺织品工业和医药等行业。但与国外同行业相比，我国中温α-淀粉酶发酵酶活单位不高，而且目前国内对其研究报道也很少。因此开展中温α-淀粉酶优良菌株选育，优化发酵工艺，提高中温α-淀粉酶发酵水平，对促进我国酶制剂工业的发展具有现实意义。
　　 本实验以中温α-淀粉酶的生产菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens为出发菌株，以α-淀粉酶活力作为筛选指标，经紫外线、微波与LiCl复合诱变后，分别以2-DOG和衣霉素抗性平板对突变株进行定向选育。复合诱变条件为:紫外线照射6min，微波照射20s，LiCl浓度1.2%；筛选条件为:2-DOG5%、衣霉素50μg/mL。经过诱变，在LiCl添加浓度为1.2%的筛选平板上得到一株遗传稳定的优良突变株YL1-5，产酶较原始菌株提高了19.3%。
　　 B.amyloliquefaciensYL1-5中温α-淀粉酶(BAA)于菌体生长的对数后期开始合成，表现为延续合成型-酶合成与菌体生长部分偶联。添加浓度为1.5%的沸石(40～60目)，2%的沸石(20～40目)或者2%的膨润土可以有效的吸收发酵过程中产生的NH4+，其中添加1.5%的沸石(40～60目)使得酶活力比对照组提高了11.88%。优化后的摇瓶培养基为:玉米粉16%，棉籽饼粉8%，玉米浆粉1.0%，沸石(40～60目)1.0%，CaCO30.8%。优化后的培养条件为:挡板三角瓶(250mL)，装液量25mL/250mL，初始pH7.0，种龄16h，接种量5%(V/V)，培养温度34℃，转速190rpm，经优化后菌株产酶活力为533.2U/mL，比优化前提高了27.19%。30L发酵罐上分批发酵结果不如摇瓶的好，原因可能在于菌体浓度过低；采用30h后补料工艺，可以使菌体得到更好生长，酶活力达到521.6U/mL。
　　 对突变株B.amyloliquefaciens YL1-5所产中温α-淀粉酶的酶学性质研究得出:该酶作用的最适温度为60℃，最适pH为6.0。在90℃高温下，添加0.05mol/L的Ca2+可以使得酶活力比不添加Ca2+提高62.1%。在pH6.5～9.5范围内，BAA能够保持较高的酶活性，其中在pH8.0的缓冲液放置24h后，酶活力只减少了3%，说明该酶在碱性条件下能够保持较好的稳定性。金属离子中Na+、Li+、Mg2+对BAA有一定的激活作用，Hg2+对其有强烈的抑制作用，Sr2+、2ri2+、Mn2+、Ba2+也有抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1 淀粉酶的简介

1.1.1 淀粉酶发展历史

1.1.2 淀粉酶分类

1.1.3 α—淀粉酶的结构

1.1.4 α—淀粉酶的应用

1.2 中温α—淀粉酶研究现状

1.2.1 生产菌株研究现状

1.2.2 发酵研究现状

1.2.3 中温α—淀粉酶学性质研究现状

1.3 课题意义及内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 粗酶液

2.1.4 主要试剂与设备

2.2 实验方法

2.2.1 测定方法

2.2.2 菌株诱变选育

2.2.3 摇瓶发酵工艺的研究

2.2.4 30L发酵罐发酵研究

2.2.5 酶学性质的研究

第三章 结果与讨论

3.1 菌株的诱变选育结果

3.1.1 出发菌株的生长曲线

3.1.2 诱变剂量的确定

3.1.3 诱变结果

3.2 摇瓶发酵研究

3.2.1 突变株YL1—5 的发酵曲线

3.2.2 挡板三角瓶对产酶的影响

3.2.3 不同碳源对产酶的影响

3.2.4 不同碳源浓度对产酶的影响

3.2.5 不同氮源对产酶的影响

3.2.6 不同氮源浓度对产酶的影响

3.2.7 CaCO3 对产酶的影响

3.2.8 玉米浆粉对产酶的影响

3.2.9 缓冲液对产酶的影响

3.2.10 沸石对产酶的影响

3.2.11 主要营养成分正交试验

3.2.12 初始pH对产酶的影响

3.2.13 接种量对产酶的影响

3.2.14 种龄对产酶的影响

3.2.15 转速对产酶的影响

3.2.16 温度对产酶的影响

3.2.17 Tween—80 对产酶的影响

3.2.18 金属离子对产酶的影响

3.3 30L发酵罐发酵研究

3.3.1 突变株YL1—5 分批发酵培养

3.3.2 突变株YL1—5 的补料分批发酵培养

3.4 酶学性质研究

3.4.1 酶的最适温度

3.4.2 酶的温度稳定性试验

3.4.3 Ca2+对酶稳定性的影响

3.4.4 酶作用的最适pH

3.4.5 酶的pH稳定性试验

3.4.6 不同金属离子对酶活力的影响

第四章 结论与展望

4.1 主要结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录