参麦注射液对新生大鼠HIBD的干预研究——脑组织Caspase-3基因和蛋白表达及大鼠实验行为预后评定

摘要

缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是威胁新生儿生命以及导致患儿神经系统后遗症的严重疾病之一,主要原因是围生期窒息.其发病机制复杂,有多种因素参与.当前公认在未成熟脑中,神经元的死亡主要是凋亡,而caspase家族尤其caspase-3在凋亡中发挥关键作用.该病目前总体治疗方法及效果不尽如意,远期疗效(预后)方面的报道甚少.该实验目的:通过建立标准化新生儿HIBD实验动物模型,观察HIBD后大鼠的外观特点、行为变化以及皮质与海马部位caspase-3的表达规律.并通过药物(参麦和胞二磷胆碱)分别干预,分别检测上述指标,并对实验后成年鼠行为学检测,进一步探讨药物的治疗作用及远期疗效.研究方法:按Rice法建立标准化新生儿缺氧缺血脑损伤模型,采用RT-PCR技术与免疫组织化学方法,分别检测各组缺氧缺血后第0、6、12、24、48h及5、7d皮质与海马组织中caspase-3基因在转录及翻译水平的表达,进行疗效评价;采用Y形电迷宫对各组缺氧缺血后第60、61d及90、91d实验大鼠进行行为学及记忆能力检测,探讨远期疗效.该实验观察到以下结果:1.正常大鼠脑组织海马、皮质部位caspase-3 mRNA表达没有统计学差别(p>0.05).2.经过参麦和胞二磷胆碱(CDPC)分别干预,实验动物行为及大体外观与模型组相比有统计学差异(p<0.05).3.通过RT-PCR方法发现,HIBD后caspase-3 mRNA表达有两个高峰:分别在Oh和12-48h;第一高峰时间短,峰值低,皮质与海马表达差别不明显;第二高峰时间长,峰值高,海马区比皮质区延迟数小时,同侧皮质和海马差别不明显,但结扎侧高于未结扎侧.参麦和胞二磷胆碱均可减少其各时间点尤其第二高峰的表达(p<0.01),参麦更明显.4.应用免疫组织化学方法,HIBD后caspase-3的蛋白表达曲线类似于RT-PCR表达;结扎侧表达高于未结扎侧.参麦和胞二磷胆碱均可减少阳性细胞表达(p<0.01).前者更明显.5.HIBD实验大鼠第60、61d及90、91d行为学检测发现,经过参麦和胞二磷胆碱分别干预后学习及记忆效果均较HIBD组改善(p<0.05),参麦组与胞二磷胆碱组之间也有统计学差异(p<0.05).结论:1.正常大鼠脑组织海马、皮质部位均有caspase-3 mRNA及蛋白少量表达.2.参麦和胞二磷胆碱均可减轻新生大鼠HIBD后脑组织损害.3.新生大鼠脑缺氧缺血损伤后,皮质与海马caspase-3 mRNA及蛋白表达有两个高峰.第一高峰可能主要与线粒体原发损伤有关,第二高峰可能与线粒体继发损伤有关,损伤程度强于第一高峰,形式以凋亡为主.4.参麦和胞二磷胆碱均对HIBD神经元有保护作用,并有抑制调亡作用.5.参麦和胞二磷胆碱均可改善HIBD的预后,从远期疗效分析证实,前者更满意.

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引论(前言)

1 HIBD发病机理的有关研究：

2 HIBD的防治

第一章材料与方法

1研究对象

2主要试剂

2.1干预药物

2.2 RT-PCR有关试剂

2.3免疫组化相关试剂

3主要仪器与材料

4实验方法

4.1动物模型及动物分组

4.2脑组织RNA的提取及逆转录扩增(RT-PCR)

4.3 HE染色及免疫组织化学检测

4.4动物大体病理及行为学测试

第二章实验结果

1大体形态的观察

活体大鼠外观所见

脑外观

2RT-PCR：

2.1正常新生大鼠海马及皮质区Caspase-3 mRNA表达及相对含量测定

2.2假手术组不同部位Caspase-3 mRNA表达及相对含量测定

2.3 HIBD海马区及皮质区Caspase-3 mRNA表达及相对含量测定

3HE染色及免疫组织化学结果

3.1 HE染色

3.2免疫组织化学

4行为学检测

4.1开场行为(open field behavior)观察

4.2 Y形迷宫实验

第三章讨论

1.新生儿HIBD模型及其建立

2.新生脑缺氧缺血损伤与细胞凋亡

2.1.细胞凋亡的意义及检测手段

2.2. HIBD与细胞凋亡

3.CASPASE-3与新生脑HIBD

4.海马延迟性神经元死亡与HIBD预后

5.CDPC与HIBD

6.参麦与HIBD

第四章结论

致谢

参考文献

作者简介及在学期间发表论文清单

本实验实HIBD凋亡相关研究索引