肿瘤细胞膜上核苷载体的荧光标记、分析及实用性研究

摘要

本论文利用荧光分析法对细胞膜上的核苷载体进行了标记与定量分析研究,主要内容包括:提出用潘生丁作为荧光标记物测定细胞膜上的核苷载体的新方法.实验考察了潘生丁的荧光光谱特性,探讨了溶液pH值、温度、放置时间等因素对潘生丁荧光强度的影响,优化了潘生丁测定的实验条件.在优化实验条件下,潘生丁的浓度与其荧光强度在1.0×10<'-12>到1.0×10<'-9>M之间呈线性,线性方程为F=1.37+17.3×C,相关系数为0.997,方法的最低检出限为2.8×10<'-13>M,样品在浓度为1.0×10<'-12>-1.0×10<'-9> M之间测定的平均相对标准偏差为2.7％(n=9).潘生丁与胰腺肿瘤细胞孵育30分钟后,测得细胞膜样品溶液中潘生丁的浓度为2.9(±.24)×10<'-11>M,单个细胞表面上与潘生丁结合的核苷载体的数量为1.75(±0.14)×10<'5>个.与其它核苷载体的定量分析方法相比,本方法简单方便,灵敏度高,不存在放射危害.潘生丁除了作为核苷载体ENT的高效荧光标记物之外,它还是一种核苷载体ENT的阻断剂.在标记核苷载体ENT的同时,还能发挥阻断作用,阻止进入肿瘤细胞内的核苷类抗肿瘤药物顺浓度梯度流出细胞外,并从而可望提高联合化疗的疗效.具有其他核苷载体ENT阻断剂所不可替代的优点.为了考察潘生丁对阻断核苷载体ENT的作用,建立了细胞内核苷衍生物类药物6-巯基嘌呤的测定方法.考察了6-巯基嘌呤的荧光光谱特性,研究了溶液pH值、温度、放置时间等因素对6-巯基嘌呤荧光强度的影响,获得6-巯基嘌呤测定的优化条件.6-巯基嘌呤的浓度与其荧光强度在4.0×10<'-11>到4.0×10<'-6>M之间呈线性,相关系数为0.9997,线性方程为F=95.8C+1.6,方法的最低检出限为8.2×10<'-12> M,样品在浓度为4.0×10<'-12>-4.0×10<'-6>M之间的相对标准偏差为4.3％(n=9).6-巯基嘌呤与胰腺肿瘤细胞孵育60分钟后,计算出实验样品溶液中细胞内6-巯基嘌呤的浓度为2.38±0.088 nM.方法简单方便,灵敏度和精密度高.可作为临床细胞内6-巯基嘌呤测定的一种参照方法.本研究考察了作为核苷载体阻断剂的潘生丁对细胞膜上核苷载体转运6-巯基嘌呤的影响.胰腺肿瘤细胞在体外与潘生丁孵育时,孵育初期细胞膜上潘生丁的浓度迅速提高,30分钟后达到结合平衡.固定孵育时间30分钟,细胞膜上潘生丁的浓度随细胞外潘生丁浓度的增加而增加,细胞外潘生丁浓度达200 μM后趋于结合平衡并由此测算出20℃时潘生丁在胰腺肿瘤细胞膜上的结合常数为4.7(±0.53)×10<'10>M<'-1>.未加潘生丁的6-巯基嘌呤在与胰腺肿瘤细胞孵育60分钟,细胞外6-巯基嘌呤的浓度在60 μM时细胞内6-巯基嘌呤的浓度达到饱和.加入潘生丁后观察到细胞内6-巯基嘌呤的浓度比未加前的浓度提高了0.49倍,前后实验结果有统计学显著性差异(p<0.05),实验结果验证了潘生丁对核苷载体阻断的机制是对ENT的阻断而非对CNT的阻断.潘生丁通过对平衡型ENT的阻断,防止了ENT把6-巯基嘌呤从细胞内泵出;而单向主动转运型CNT并未被潘生丁阻断,它仍然可以把6-巯基嘌呤从细胞外转运至细胞内,由此增加了细胞内6-巯基嘌呤的浓度.可望为在临床上提高化疗效果提供理论依据.体外细胞实验结果表明,潘生丁阻断平衡型核苷载体的用量应该大于200 μM,为临床上潘生丁的使用提供了实验依据.

目录

文摘

英文文摘

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前言

1.1细胞和细胞膜

1.2细胞膜核苷载体及核苷载体的转运机制

1.2.1细胞膜核苷载体蛋白及其分类

1.2.2核苷载体的转运机制

1.2.3核苷载体ENT的转运阻断

1.3细胞膜上核苷载体在肿瘤治疗中的作用

1.4细胞膜上核苷载体的现有分析方法

1.5参考文献

第一部分细胞膜上ENT核苷载体的潘生丁荧光标记及荧光分光光度法测定

1.1引言

1.2实验部分

1.2.1仪器

1.2.2试剂

1.2.3实验方法

1.3结果与讨论

1.3.1潘生丁的荧光光谱特征

1.3.2 pH对潘生丁荧光强度的影响

1.3.3时间和温度对潘生丁荧光强度的影响

1.3.4潘生丁测定的标准曲线和方法的灵敏度

1.3.5胰腺肿瘤细胞个数的计量

1.3.6胰腺肿瘤细胞膜上潘生丁的标记与定量测定

1.4结论

1.5参考文献

第二部分阻断ENT核苷载体对肿瘤细胞转运核苷类抗肿瘤药物的影响

第一章胰腺癌细胞内抗肿瘤药物6-巯基嘌呤的荧光分光光度法测定

2.1.1引言

2.1.2实验部分

2.1.3.结果与讨论

2.1.4结论

2.1.5参考文献

第二章潘生丁对胰腺肿瘤细胞膜上核苷载体转运6-巯基嘌呤的影响

2.2.1引言

2.2.2实验部分

2.2.3结果与讨论

2.2.4结论

2.2.5参考文献

结 语

核苷载体及蛋白质荧光标记研究进展

发表论文

致 谢