蛋白质微阵列技术在检测TORCH感染中的实验研究

摘要

目的：对玻片表面六种不同修饰方法进行比较，探讨制备蛋白质微阵列的合适的玻片表面修饰方法；研究分别采用荧光素和胶体金为检测信号制备TORCH感染检测蛋白质微阵列。 方法：以玻片为基质，采用六种不同方法对玻片表面进行修饰，对其接触角进行测量，采用原子力学显微镜对其表面进行表征，通过将不同浓度的人IgM点样于修饰后的玻片制备蛋白质微阵列，比较不同修饰方法对蛋白质的固定效率，以及检测的线性范围、背景等；采用玻片表面修饰琼脂糖膜制备蛋白质微阵列，以生物素标记二抗，利用生物素和链霉亲和素的强大亲和力，检测血清中TORCH IgM抗体；抗原点样于被琼脂糖膜修饰的玻片表面，将胶体金标记的抗体和微阵列进行孵育，采用银加强放大微阵列信号，肉眼观察或普通的平板扫描仪记录结果。 结果：测量修饰后的玻片的接触角，对玻片表面进行表征，对蛋白质的固定效率、固定的效果进行综合分析，琼脂糖修饰玻片的表面接触角较大，其表面不仪有多孔结构，而且有一定厚度，结合蛋白质分子的能力最大，其点的变异度较小，没有拖尾现象，点较圆润，背景较低；以荧光为检测信号，基于生物素一链霉亲和素系统制备的TORCH感染检测蛋白质微阵列，IgM的最低检出量为0.25pg，蛋白质微阵列和ELISA法同时对CMV、RV、TOX和HSV II IgM抗体总的检测诊断符合率为97.1﹪；采用免疫金银染色法制备的TORCH感染检测蛋白质微阵列，IgM的最低检出量为12.5pg，微阵列和ELISA法同时对CMV、RV、TOX和HSVIIIgM抗体总的检测诊断符合率为93.3﹪。 结论：琼脂糖修饰的玻片是一种理想的制备蛋白质微阵列的表面修饰方法。分别采用荧光和免疫胶体金为检测信号制备的TORCH感染检测蛋白质微阵列，具有高信息通量、低成本、制备与检测快速简单的优点，展示了良好的应用前景。

目录

文摘

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绪论(前言)

第一章文献综述

1.1围产期母婴TORCH感染的诊断

1.1.1、病原学的方法

1.1.2、免疫学的方法

1.1.3、分子生物学的诊断方法

1.2、蛋白质微阵列的概念和原理

1.3、蛋白质微阵列载体的选择

1.3.1、塑料和滤膜

1.3.2、载玻片

1.3.3、分子自组装技术

1.4、微阵列的点印

1.5、微阵列的封闭

1.6、微阵列的检测

1.6.1、无探针标记检测法

1.6.2、探针标记检测法

1.6.3、蛋白质微阵列检测技术的展望

1.7、蛋白质微阵列技术的特点

1.8、蛋白质微阵列在临床医学中的应用

1.8.1、感染性疾病的诊断

1.8.2、自身免疫性疾病的诊断

1.8.3、肿瘤表面标志物的检测

1.8.4、过敏性疾病的检测

1.8.5、心肌梗阻的诊断

第二章用于制备TORCH感染检测蛋白质微阵列的玻片表面修饰方法研究

2.1、引言

2.2、实验材料和仪器

2.2.1、主要试剂和材料

2.2.2、实验仪器

2.2.3、主要用液成分及配制

2.3、实验方法

2.3.1、玻片表面的修饰方法

2.3.2、修饰后玻片的接触角测量

2.3.3、修饰后玻片的的原子力学显微镜表征

2.3.4、Cy3标记羊抗人IgM抗体

2.3.5、不同的玻片表面修饰方法用于蛋白质微阵列的制备

2.3.6、不同的玻片表面修饰方法制备蛋白质微阵列的重复性

2.3.7、统计学处理

2.4、实验结果

2.4.1、修饰后玻片的接触角测量

2.4.2、修饰后玻片的的原子力学显微镜表征

2.4.3、Cy3标记羊抗人IgM抗体的荧光标记效率

2.4.4、不同修饰方法的玻片对人IgM的固定能力

2.4.5、不同表面修饰的玻片制备微阵列的玻片内的变异度

2.5、讨论

2.6、结论

第三章荧光素标记检测法在蛋白质微阵列检测TORCH感染中的实验研究

3.1、引言

3.2、实验材料和仪器

3.2.1、标本来源

3.2.2、主要试剂和材料

3.2.3、实验仪器

3.2.4、主要用液成分及配制

3.3、实验方法

3.3.1、琼脂糖凝胶膜的制备与玻片的预处理

3.3.2、不同点样针用于微阵列点样的比较

3.3.3、非接触型喷墨点样和接触式点样针制备微阵列比较

3.3.4、间接检测法与生物素-链霉亲和素系统的比较

3.3.5、TORCH抗原点样浓度的确定

3.3.6、IgM检测的线性范围

3.3.7、IgM标准曲线的制备

3.3.8、TORCH检测蛋白质微阵列的制备和血清中IgM抗体的检测

3.3.9、TORCH感染检测蛋白质微阵列Cutoff值的确定

3.3.10、血清标本的ELISA检测

3.3.11、统计学处理

3.4、实验结果

3.4.1、不同点样针用于微阵列点样的比较

3.4.2、非接触型喷墨点样和接触式点样针制备微阵列比较

3.4.3、间接检测法与生物素-链霉亲和素系统的比较

3.4.4、TORCH抗原点样浓度的确定

3.4.5、IgM检测的线性范围和标准曲线的制备

3.4.6、血清中TORCH IgM抗体的检测

3.4.7、TORCH感染检测蛋白质微阵列Cutoff值的确定

3.4.8、蛋白质微阵列和ELISA法的比较

3.5、讨论

3.6、结论

第四章免疫金银染色法在蛋白质微阵列检测TORCH感染中的实验研究

4.1、引言

4.1.1、胶体金的结构

4.1.2、胶体金的特性

4.1.3、胶体金的制备

4.1.4、胶体金标记物的制备

4.1.5、胶体金在生物学研究中的应用

4.2、实验部分

4.2.1、标本来源

4.2.2、主要试剂和材料

4.2.3、实验仪器

4.2.4、主要用液成分及配制

4.2.5、胶体金的制备与抗体探针的标记

4.2.6、胶体金颗粒的鉴定

4.2.7、免疫金探针的标记和鉴定

4.2.8、琼脂糖凝胶膜的制备与玻片的预处理

4.2.9、IgM标准曲线的制备

4.2.10、TORCH感染检测蛋白质微阵列的制备

4.2.11、微阵列信号的检测与信号采集

4.2.12、TORCH感染检测蛋白质微阵列的测定结果判定

4.2.13、TORCH IgM抗体的ELISA检测

4.2.14、统计学分析

4.3、实验结果

4.3.1、胶体金颗粒的鉴定

4.3.2、免疫金探针的标记和鉴定

4.3.3、微阵列检测的灵敏度

4.3.4、IgM标准曲线的制备

4.3.5、TORCH抗原点样浓度的确定

4.3.6、TORCH感染检测蛋白质微阵列的制备条件优化

4.3.7、TORCH IgM抗体的检测

4.3.8、蛋白质微阵列与ELISA检测结果比较

4.4、讨论

4.5、结论

第五章结论

致谢

参考文献

作者简介及在学期间课程学习和学术交流情况

本实验制备TORCH感染检测蛋白质微阵列的实验步骤示意图