支原体在性传播感染中的作用及其耐药机理研究

摘要

目的：1、全面了解Uu、Mh、Mg、Mf、Mpe和Mpi等6种支原体在HIV阳性者、AIDS患者、其他性病患者及高危人群、妇科生殖道炎症患者、健康女性和男性等多种不同人群中的流行特征；2、在女性人群进一步探讨 Uu 和 Mh的致病性：3、研究Uu和Mh的耐药现状并提出合理的用药建议；4、探讨Uu对四环素类、氟喹诺酮类和大环内酯类药物的耐药机制；5、研究支原体与淋病奈瑟菌的合并感染状况及淋病奈瑟菌的耐药性和耐药机制。 研究方法：1、研究对象分别来自江苏省南京、南通、无锡以及徐州的性病监测医院或/和门诊就诊者，某综合性医院妇科门诊患者，部分单位健康体检者，以及省内几个主要地区的HIV阳性者和AIDS患者。2、采用流行病学现况调查的方法，在上述各人群中开展问卷调查、采集泌尿生殖道分泌物标本或/和首段尿，并对每个个体进行医学检查和临床诊断。3、用法国梅里埃支原体培养及鉴定试剂进行Uu与Mh的初步分离和鉴定，并进一步经过滤培养和特异性PCR试验进行确认。4、比较 HIV阳性者、AIDS患者、其他性病患者及其性病高危人群、健康体检者、妇科生殖道感染者等人群6种支原体检出情况，并分析其流行特征。5、在性病女患者、妇科炎症患者及女性健康体检者分析 Uu、Mh的检出情况、比较其感染浓度，分析支原体的致病性与感染浓度、基因分型的关系，并通过随访观察正常人群中支原体的自然消长情况及临床患者在实施抗支原体治疗前后，其临床症状和支原体感染浓度的变化。6、采用叉生分析法分析Uu、Mh与其它妇科生殖道常见病原体之间的交互作用。7、先期采用法国梅里埃支原体药敏试剂盒定性检测Uu、Mh临床分离株的耐药性，后期应用微量肉汤稀释法检测八种抗生素对确认的Uu、Mh的最小抑菌浓度。8、按药敏结果分层，在部分Uu菌株中进行耐药基因检测和分析，采用Blast比对法比较临床菌株序列与标准菌株序列的差异。9、在各性病监测点调查支原体与淋病合并感染状况，对淋球菌进行相应的药敏试验和耐药基因检测及序列分析，主要实验技术和方法与支原体研究相同。 研究结果： 1．支原体感染的流行特征研究结果,多因素分析显示女性及小于25岁是性病门诊患者Uu或/和Mh感染的危险因素。 2．Uu、Mh在女性人群中的致病性研究结果：(1)序贯试验显示Uu、Mh在阴道穹窿部的检出均高于子宫颈，这种差异在生殖道不同部位感染者及非生殖道感染者中均存在。(2)本研究共调查检测女性609例，Uu、Mh平均总阳性率为59.44％，其中性病及高危人群、妇科炎症患者、健康体检者的Uu、Mh总阳性率分别为79.66％、75.31％3,44.38％，健康者的支原体阳性率显著低于性病人群和妇科炎症患者。(3)性病患者、妇科炎症患者和健康体检者Uu感染的平均浓度分别为10<'3.23>、10<'3.33>、和10<'2.46>CCU，Mh感染的平均浓度分别为10<'3.00>、10<'3.09>和10<'1.78>CCU，健康体检者支原体感染浓度显著低于性病患者和妇科炎症患者。(4)目前有21例被纳入抗支原体治疗的妇科炎症患者接受了治疗后的复查，经比较治疗后感染的平均CCU均有明显下降，与之相对应的是疾病症状体征的明显改善或全愈。(5)3次随访结果显示健康体检人群支原体的携带浓度较低，且CCU浓度无显著变化。 3．Uu和Mh的耐药性研究结果：(1)在定性药敏试验中，Uu对环丙沙星和氧氟沙星的耐药率为87.8％和46.3％，对其它药物耐药率均低于10％；Mh对环丙沙星和氧氟沙星的耐药率为62.5％和43.8％，对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素的耐药率分别为100％、62.5％、100％1 Uu和Mh对强力霉素、交沙霉素、原始霉素均较敏感，耐药率都在5％以下。其中，Uu对环丙沙星耐药率显著高于Mh，而 Mh对大环内酯类药物的耐药率明显高于Uu。(2)在定量药敏试验中，米诺环素、四环素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、环丙沙星、氧氟沙星和左旋氧氟沙星对Uu的MIC<,50>(50％的菌株被抑制的浓度)分别为<0.0625、<0.125、0.25、1、2、8、4和2mg/L；MICgo(90％的菌株被抑制的浓度)分别为0.125、1、1、4、8、64、16和8mg/L。Uu临床株对8种药物耐药率从高到低分别为环丙沙星、左旋氧氟沙星、氧氟沙星、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、四环素和米诺环素。40.47％的菌株都同时对3种以上的抗生素有耐药性。(3)所有Mh菌株对米诺环素和四环素100％敏感，对克拉霉素和阿奇霉素100％耐药，对氟喹诺酮类药物的敏感性也较低。(4)不同生物型别的Uu对四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮类药物的MIC水平存在统计学差异，表现为生物2型高于生物1型。 4．Uu的耐药机制研究结果：(1)在52株具有定性药敏试验结果的Uu菌株中，对四环素敏感株、中敏株、耐药株tetM检出率分别为26.7％、71.4％、86.7％；tetM基因阳性菌株产生四环素耐药的危险性是tetM基因阴性菌株的17.785倍。(2)在34株非四环素耐药的Uu菌株中，有7株检测到tetM基因;tetM基因阳性组的四环素和米诺环素的MIC水平显著高于tetM阴性组。(3)发生gyrA基因突变的均为氟喹诺酮类药物的耐药菌株和中度敏感菌株，在敏感菌株没有发现gyrA基因突变；环丙沙星耐药组gyrA基因突变率(65％)明显高于环丙沙星中敏组(25％)和敏感组(0)。(5)在选取的部分红霉素耐药菌株中扩增23SrRNA基因片段进行测序，均未发现突变点。 5．支原体与淋球菌合并感染及淋球菌耐药性研究结果：(1)南京、徐州、无锡、南通等地区性病门诊就诊者中，淋病平均患病率为25.7％左右，男性显著高于女性。(2)性病门诊就诊者中，淋病合并支原体感染占37.8％。(3)头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、青霉素、大观霉素、四环素、环丙沙星、氧氟沙星对95株淋球菌的MIC<,50>分别为0.06、0.03、0.12、32、32、2、4、4μg/ml，MIC<,90>分别为0.12、0.06、0.5、64、32、64、16、8μg/ml。对几种药物耐药率从高到低分别为环丙沙星(100％)、四环素(78.9％)、青霉素(68.4％)、大观霉素(1.05％)。(4)95株淋球菌中，抗四环素淋病奈瑟菌的阳性率为28.4％；对四环素中度敏感株和耐药株的term基因检出率分别为0、44.7％，二者之间差异有统计学意义；TRNG株与非TRNG株tetM基因检出率分别为93.3％、9.1％，二者之间差异有统计学意义。 主要研究结论： 1．Uu、Mh、Mg、Mf、Mpe和Mip等6种支原体存在于多种性传播感染人群中，其中的艾滋病相关支原体Mf、Mpi在HIV阳性者及AIDS患者中的感染率显著高于其他人群，且感染率高低与HIV感染的不同阶段有关，AIDS发病期的感染率高于HIV感染潜伏期。感染率普遍较高的是Uu和Mh，其感染率存在地区差异和性别差异。 2．虽然Uu和Mh在女性人群中存在一定比例的无症状携带现象，但按照流行病学的病因判断标准，在联系强度、剂量反应关系、分布的一致性、可逆转性等多方面均已证实二者对女性生殖道炎性疾病的致病作用不容忽视，尤其是二者合并感染时更易导致疾病的发生，这种致病性与支原体的感染浓度CCU呈正相关，同时Uu、Mh与女性生殖道常见致病病原体(阴道加德纳氏菌、沙眼衣原体、假丝酵母菌等)在致病性上有相加和/或相乘的协同作用。本研究未显示出不同生物型的Uu在致病性上存在差异。此外，由序贯试验研究结果显示Uu、Mh的检测应取阴道后穹窿标本或病变部位标本，前者可减少漏诊，后者更具针对性，同时结合支原体的感染浓度和受检者的临床症状与体征，以制定更科学的医疗决策。 3．在江苏局部地区Uu临床株对第1、2代氟喹诺酮类药物耐药严重，此类药物不宜作为治疗Uu感染的一线药物，而四环素类药物可以重新作为治疗Uu感染的一线药物，尤其是米诺环素抗菌效果最好，其次为克拉霉素和阿奇霉素。Mh株对大环内酯类药物具有天然的耐药性，对四环素类药物则有较好的敏感性。不同生物型的Uu对四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮类药物的敏感性存在差异，生物2型的MIC平均水平高于生物1型，提示23SrRNA序列的差异与各类药物的耐药性有一定的关系。 4．tetM基因是导致Uu菌株出现四环素类耐药的主要原因，但并非唯一原因；Uu对氟喹诺酮类药物的耐药主要是由于gyrA基因突变导致相应氨基酸改变所介导，MIC水平与gyrA基因和parC基因突变密切相关；在耐红霉素的Uu菌株中未出现其它微生物中存在的与红霉素耐药相关的23SrRNA基因的改变，由于扩增与测序的片段有限，尚不能提供Uu对红霉素的耐药与23SrRNA基因之间的关系。Uu生物型与氟喹诺酮类药物耐药相关的gyrA基因所表达的氨基酸改变有高度的相关性，生物2型均出现gyrA编码氨基酸Asp95Glu的改变。 5．在性病患者中存在相当比例的支原体与淋球菌的合并感染，临床诊断和治疗时均应予以重视。江苏部分地区的淋球菌对环丙沙星药物耐药严重，该药物已不再适用于临床治疗淋病。gyrA和parC基因突变所致的氨基酸改变在耐药菌株中普遍存在，gyrA基因的突变位点与MIC水平密切相关，parC基因所表达的氨基酸的改变主要介导氟喹诺酮类药物高水平的耐药。淋球菌对大观霉素的耐药是由16SrRNA基因突变所介导。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词注释表

声明

前言

第一章支原体感染的流行特征

1.1研究对象与方法

1.1.1研究对象

1.1.2问卷调查

1.1.3临床标本采集

1.1.4 Uu和Mh的分离培养与鉴定

1.1.5Mg、Mf、Mpe和Mpi的检测

1.1.6资料统计分析

1.2结果

1.2.1 HIV阳性者及AIDS人群支原体感染的流行特征

1.2.2其它人群中支原体感染的流行特征

1.2.3性病门诊患者Uu和Mh感染的影响因素

1.3讨论

1.3.1 HIV/AIDS人群中支原体感染状况

1.3.2其他性病患者及高危人群、健康体检者中支原体感染状况

1.3.3支原体感染的危险因素

1.4小结

本章参考文献

第二章解脲脲原体和人型支原体的致病性研究

2.1研究对象和方法

2.1.1研究对象

2.1.2调查方法

2.1.3标本采集方法

2.1.4 Uu和Mh的分离培养与鉴定

2.1.5 Uu和Mh感染浓度CCU的检测

2.1.6 Uu菌株的生物型检测

2.1.7其它妇科常见病原体的检测

2.1.8资料统计分析

2.2结果与分析

2.2.1不同采样部位支原体检出情况比较

2.2.2不同女性人群Uu和Mh的感染状况

2.2.3 Uu、Mh的感染浓度CCU检测及随访结果分析

2.2.4 Uu生物型与疾病的关系

2.2.5 Uu、Mh与其它妇科常见病原体之间的交互作用分析

2.3讨论

2.3.1不同部位支原体的检出情况

2.3.2 Uu、Mh对女性生殖道的致病性

2.3.3Uu、Mh与其他病原体的交互作用

2.4小结

本章参考文献

第三章解脲脲原体和人型支原体的耐药性研究

3.1材料与方法

3.1.1 Uu和Mh临床分离菌株

3.1.2支原体的定性药物敏感性试验

3.1.3支原体的定量药物敏感试验

3.1.4 Uu菌株的生物型检测

3.1.5资料统计分析

3.2结果

3.2.1 Uu与Mh的定性药敏试验结果

3.2.2 Uu的MIC药敏试验结果

3.2.3 Mh的MIC药敏试验结果

3.2.4 Uu药敏结果与菌株生物型的关系

3.3讨论

3.3.1 Uu与Mh定性药敏情况

3.3.2 Uu与Mh的抗生素MIC分析

3.3.3 Uu对抗生素敏感性的影响因素

3.3.4 Uu生物型与其抗生素MIC的关系

3.4小结

本章参考文献

第四章解脲脲原体的耐药机理研究

4.1材料与方法

4.1.1 Uu菌株

4.1.2耐药基因检测

4.1.3资料统计分析

4.2结果

4.2.1四环素耐药相关tetM基因检测结果

4.2.2 gyrA耐药基因检测结果

4.2.3 parC耐药基因检测结果

4.2.4 23SrRNA耐药基因检测结果

4.3 讨论

4.3.1 tetM基因与四环素耐药的关联性

4.3.2 gyrA和parC基因与氟喹诺酮类药物耐药的关联性

4.3.3 23SrRNA基因与大环内酯类药物耐药的关联性

4.4小结

本章参考文献

第五章支原体与淋球菌的合并感染及淋球菌的耐药性研究

5.1材料与方法

5.1.1研究对象

5.1.2标本采集方法

5.1.3淋球菌的分离培养与鉴定

5.1.4菌种保存

5.1.5淋球菌的药敏试验

5.1.6淋球菌的耐药基因检测

5.1.7数据分析与统计学处理

5.2结果

5.2.1性病门诊患者淋球菌感染状况

5.2.2淋球菌与支原体的混合感染

5.2.3淋球菌的药物敏感性

5.2.4淋球菌耐药基因检测结果

5.2.5 gyrA基因突变类型与氟喹诺酮类药物MIC的关系

5.2.6 parC基因错义突变数量与氟喹诺酮类药物MIC的关系

5.3讨论

5.3.1支原体与淋球菌合并感染情况

5.3.2江苏省部分地区淋球菌耐药情况

5.3.3淋球菌的耐药基因

5.4 小结

本章参考文献

总结与展望

附录

综述之一：解脲脲原体致病性研究进展

综述之二：解脲脲原体耐药状况及耐药机制研究进展

综述之三：淋病奈瑟菌耐药机制及耐药基因检测研究进展

作者简介

学习期间发表及已录用的相关论文

学习期间发表的其他论文

致谢