乳腺癌患者CTC检测及其与CSC相关性研究

摘要

细胞角蛋白(cytokeratin，CK)19、CK20 mRNA是文献报道中研究最为广泛的检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)的组织特异性基因标志，但近年来一些报道相继对这两个标志物的特异性、敏感性提出质疑。另一方面，2003年，Al-Hajj等在乳腺癌中发现了癌干细胞(canceerstem cell，csc)，其表型为CD44<'+>/CD24<'->。根据CSC学说，只有CSC才具备肿瘤形成能力，而非CSC乳腺癌细胞即使进入外周血也无法在新的组织器官形成转移灶，所以检测乳腺癌患者外周血具备CSC活性的CTC更有临床应用价值，但关于乳腺癌患者外周血微转移与CSC是否存在相关性目前尚未见相关报道。鉴于此，我们进行了以下研究。 目的：分别检测健康志愿者和乳腺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中CKl9、CK20mRNA表达，评估其作为循环肿瘤细胞(CTC)检测标志物的特异性和敏感性；并分别检测乳腺癌患者PBMC中CTC和具有癌干细胞(CSC)标志的CTC(CSO-CTC)，探讨乳腺癌患者外周血微转移与CSC的相关性。 方法：运用RT-PCR分别检测健康志愿者和乳腺癌患者外周血CKl9、CK20 mRNA，并与流式细胞术(FCM)检测结果比较；乳腺癌患者和健康志愿者PBMC与磁珠藕联的上皮细胞黏附分子(EpCAM)单克隆抗体孵育后，用磁性分离富集上皮细胞。以CK<'+>为乳腺癌患者PBMC中CTC的标志，运用多参数FCM分别检测健康志愿者和乳腺癌患者的PBMC中CK<'+>细胞以及CK<'+>/CD44<'+>/CD24<'->细胞的含量，并比较乳腺癌患者组和对照组，以及不同肿瘤分期之间的CTC、CSC-CTC含量的差异。 结果：CKl9mRNA在健康志愿者PBMC中阳性率为60％(6/10)，乳腺癌患者组阳性率为83.3％(10/12)；CK20mRNA在健康志愿者PBMC中不表达，在乳腺癌患者中阳性率为16.7％(2/12)；运用多参数FCM方法在73.07％(19/26)的乳腺癌患者中检测到CTC，在19例检测到CTC的乳腺癌患者中18例有CSC-CTC出现(18/19，94.74％)，且CTC中CSC的比例平均为19.01％：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期乳腺癌患者PBMC中CTC含量分别为0.084±0.113％。0.870±0.796％和3.307±1.842％：CSC-CTC含量分别为0.014±0.018％，0.166±0.271％和0.483±0.121％。统计结果显示乳腺癌患者PBMC中CTC和CSC-CTC的比例与临床TNM分期相关。 结论：CKl9 mRNA在正常人PBMC中也有表达，不是一个较特异的CTC检测标志，CK20mRNA特异性较好，但若用于检测乳腺癌CTC，则需提高检测方法的敏感性。本研究初步建立了乳腺癌患者外周血CSC-CTC的检测方法，检测结果显示乳腺癌患者外周血微转移中有CSC-CTC的参与，且CTC中的CSC比例高于已报道的原位乳腺癌CSC比例(<10％)，而临床分期越晚的患者CTC和CSC-CTC的数量越多。

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文摘

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声明

绪论

综述：乳腺癌患者循环肿瘤细胞的研究进展

第一部分RT-PCR检测乳腺癌患者PBMC中CK19、CK20表达

前言

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二部分乳腺癌患者外周血微转移与CSC相关性的研究

前言

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

结论

参考文献

致 谢

附录

作者简介