AML中NRas基因点突变的检测以及信号传导通路蛋白的表达相关性研究

摘要

[目的]研究在AML中NRas基因的突变率以及在AML中及正常组中Ras蛋白下游信号传导通路上蛋白AKT,ERK1/2以及其活化形式P-AKT和P-ERK1/2的表达，从而进一步探讨AML发生发展的机制，为AML靶向治疗寻找可能的靶点。
　　 [方法]共检测2005年-2007年在我院血液科就诊的初诊AML患者48例，对照组18例，均为同期就诊的贫血、ITP患者及正常供髓者，另外培养HL-60细胞作为阳性对照。应用聚合酶链式反应-单链构象多态性法(PCR-SSCP)及直接测序检测AML中NRas基因突变率，应用Western blotting法检测蛋白AKT,ERK以及其活化形式P-AKT,P-ERK1/2的表达量的多少。
　　 [结果]48例AML中共检测到NRas基因突变4例，总突变率是8.33％,NRas61位点突变2例，NRas12/13位点突变是2例。其中NRas61突变率是4.17％，NRas12/13突变率4.17％。另外在18例对照组中，未检测到有NRas基因突变，HL-60细胞株具有NRas61位点突变。将总样本48+18例分成A,B,C三组，其中A组为AML伴NRas基因突变组(4例)，B组为AML不伴NRas基因突变组(44例)，C组为正常对照组(18例)，突变组P-AKT,P-ERK1/2的表达较正常对照组明显升高，P<0.05,有统计学意义。AML伴NRas基因突变组，AML不伴NRas基因突变组，AKT,ERK1/2，P-AKT,P-ERK1/2的表达水平较高，其中AML伴NRas基因突变组表达水平最高，但与AML不伴NRas基因突变组相比较不存在明显统计学意义；而正常对照组表达水平较低，与前两组相比存在明显统计学意义。
　　 [结论]NRas基因突变可能是AML发生发展的原因之一；它可能是通过突变导致编码的Ras蛋白构型改变，使其处于功能持续活化状态，从而激活Raf/Mek/Erk，PI3K/Akt等下游信号传导通路，最终导致AML的发生。

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文摘

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论文说明：英文缩略语

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前言

文献综述 对Ras信号传导通路的靶向治疗在恶性血液病中的应用

实验 第一章:实验一 AML中Nras基因点突变的检测

1.标本和试剂

1.1标本来源

1.2主要试剂

1.3主要试剂配置

2.主要仪器和耗材

3.实验方法

3.1标本采集

3.2 Ficoll液分离骨髓单个核细胞方法

3.3使用DNA提取试剂盒(Genomic DNA purification kit)提取DNA

3.4 PCR扩增目的条带

3.5 PCR-SSCP 法

3.6 DNA测序

4. 结果

4.1 PCR扩增NRas基因

4.2 NRas 12,13,61位点突变分析

5.讨论

实验 第二章:实验二 AML中Nras下游信号传导通路蛋白的表达

1.标本和试剂

1.1标本来源

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4常用试剂配置

2.实验方法

2.1 蛋白的提取

2.2 SDS-PAGE检测

2.3 蛋白的Western blot鉴定

3.结果

4.讨论

第三章 结论

致谢

参考文献

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