戊型肝炎病毒IgA捕获法ELISA的首次建立及其对戊型肝炎诊断价值的评价

摘要

戊型肝炎（HE）过去被称为非甲非乙型肝炎，直到1989年Reyes等自实验感染的猕猴胆汁中，应用分子克隆技术获得了病毒的基因克隆，正式命名为戊型肝炎病毒（HEV）后，才改称为戊型肝炎。HE是经消化道传播的急性传染病，发病率逐年升高，有研究表明HEV还可通过血液途径传播，甚至通过垂直传播引起新生儿急性HE或早产，病死率高达43．75％，最近发现HE在器官移植患者中可以慢性化。HE在世界各地发展中国家广泛流行，在发达国家也有散发。我国先后曾发生多次TIE流行，1986-1988年新疆南部因水源污染发生过世界上规模最大的HE暴发流行，约有12万人发病。近年来我国HE的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已被列为因HE发病和死亡而引起的经济负担最为严重的国家之一。根据全基因序列分析，HEV在全世界主要有4个基因型：以缅甸株为代表的第1基因型、以墨西哥株为代表的第2基因型、以美国株为代表的第3基因型和以中国株为代表的第4基因型，我国早年检出的毒株主要是1型，但近年以4型散发为主。由于HE尚无特效治疗方法，也无特异性被动和主动免疫制剂可供预防。因此准确诊断HE急性感染、亚临床感染、既往感染，不仅对于患者的治疗和预后具有重要意义，还可以及早发现具有传染性的HE患者，做到及早隔离传染源，防止病毒污染水源和食物，造成大规模爆发流行的公共卫生突发事件。 RT-PCR检测HEV-RNA可用于诊断急性HE，但血液或粪便中HEV RNA持续时间较短，约30天，仅能在疾病早期做出诊断，而且操作复杂、成本高，不能在临床广泛开展。因此HE诊断主要依靠检测抗体的免疫学诊断。研究表明抗-HEV IgM是HEV急性感染的指标之一，但其检测易受类风湿因子等干扰，易产生假阳性，而抗-HEV IgG持续时间较长，不能区分急性感染还是既往感染。近年来有报道指出抗-HEV IgA也是一个HEV急性感染的指标，在大部分HE患者病程早期抗．HEV IgA和抗-HEV IgM均能被检测到，但也有小部分感染者表现为抗-HEV IgM阴性而抗-HEV IgA阳性，越来越多的研究表明抗-HEV IgA对HEV感染的诊断有重要意义。目前国内外还没有抗-HEV IgA诊断试剂盒问世，仅有瑞士的Diacheck公司能提供专门用于实验研究的HEV IgA检测试剂盒（ELISA间接法），但没有获得FDA认证，而且由于使用第1、2基因型抗原包被，导致HEV第3基因型毒株感染的检出率大幅下降。因此本文用抗人IgAα链McAb和酶标HEV多基因型重组抗原（HRP-p166Mix）在国内外首次建立一种特异、敏感的IgA捕获法ELISA用于检测抗-HEV IgA，并评价其临床意义。 本研究分为以下二个部分： 一、抗人IgA McAb的制备、纯化和鉴定 应用B淋巴细胞杂交瘤技术，以人IgA免疫7～8周龄雌性BALB/c小鼠后获得3株稳定分泌抗人IgA的杂交瘤细胞株，分别命名为582、5G12和7A8。用ELISA法测定该3株杂交瘤细胞在小鼠体内诱生的McAb腹水，抗体效价可达1：106～1：107。McAb亚类鉴定均为IgG1。以Ab SpinTrap试剂盒纯化McAb腹水后，582、5G12和7A8浓度分别为0．35mg/ml、0．3mg/ml、0．22mg/ml。纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定，在小鼠免疫球蛋白IgG重链预计分子量55kD和轻链分子量25kD处分别有一清晰条带，无杂蛋白带，说明纯化McAb达到电泳纯度。将3种McAbs分别与人IgA和人IgM反应性时，发现5B2与人IgA和人IgM同时反应，而5G12和7As只与人IgA反应；Western Blot分析进一步发现5B2只在25kD处有条带而在55kD处无条带，5G12和7A8只在55kD处有条带而在25kD处无条带。由于IgA分子包括重链（α链）和轻链（k或λ链），α链是IgA分子所特有，而轻链是各类免疫球蛋白共有，因此结果表明5B2是针对人IgA轻链的McAb，5G12和7A8是针对人IgAα链的McAbs。 二、HEV IgA捕获法ELISA的建立及其评价 首先我们对5G12和7A8捕获人IgA的能力做了比较，发现5G12捕获人IgA的效率高，因此选甩5G12包被微孔板，建立基于HEV多基因型混合抗原的ELISA IgA抗体捕获法。在优化实验条件的基础上，用本法检测1028份健康体检标本，95％的标本的吸光度（A450）值都集中在0～0．05之间，符合正态分布，其A450均值为0．016，标准差S为0．015，当临界值=阴性对照均值A+6S时，所检测1028份血清均为阴性。因此将捕获法ELISA检测抗-HEV IgA的临界值（Cutoff）设为阴性对照均值A+0．09时，如果所检标本的A值小于临界值则判为阴性，所检标本的A值大于或等于临界值则判为阳性。 用HEV IgA捕获法ELISA检测甲型肝炎患者血清26份，乙型肝炎患者血清240份，丙型肝炎患者血清58份，肝硬化患者血清32份，只有1份丙型肝炎患者的抗-HEV IgA为阳性，而其抗-HEV IgM，抗-HEV IgG，HEV-RNA也均阳性，说明该病例是HCV合并HEV感染。上述结果表明HEV IgA捕获法ELISA具有较好的特异性，与其它类型肝炎IgA抗体无交叉反应。 用所建立的HEV IgA捕获法ELISA检测2008年1月到2009年1月间收集自南京市第二医院的HE患者或疑似病例血清483份，其中抗-HEV IgM和IgG均阳性的标本150份，其抗-HEV IgA全部阳性，阳性率100％；抗-HEV IgM阳性而IgG阴性患者血清18份，其中抗-HEV IgA阳性15份，阳性率83．3％，同时检测HEV RNA，3份抗-HEV IgA阴性标本的HEVRNA也均阴性；抗-HEV IgM阴性而IgG阳性血清26份，其中有2份标本抗-HEV IgA阳性，检测这两份标本的HEV RNA均为阳性；抗-HEV IgM和IgG双阴性血清标本289份，抗-HEV IgA全部阴性。未检测到抗-HEV IgM和抗-HEV IgA同时阴性而HEV RNA阳性的标本。结果表明抗-HEV IgA与抗-HEV IgM均为HEV急性感染的指标，但并非所有HEV急性感染患者血清中均能同时检测出抗-HEV IgA和抗-HEV IgM，单独检测抗-HEV IgA或抗-HEV IgM均会造成漏诊，抗-HEV IgA与抗-HEV IgM同时检测则可提高戊型肝炎的检出率。 综上所述，基于HEV多基因型混合抗原的HEV IgA捕获法ELISA具有较好的特异性和较高的敏感性。抗-HEV IgM和抗-HEV IgA均是HEV急性感染的指标，可以用于HE的诊断，但单独检测抗-HEV IgA或抗-HEV IgM均会造成漏诊，联合检测抗-HEV IgA与抗-HEV IgM可提高急性HE的检出率，提高诊断的准确性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写词

声明

综述 戊型肝炎病毒IgA抗体的研究进展

前言

第一章 抗人IgA单克隆抗体的制备、鉴定

一、前言

二、材料和方法

2.1 材料

2.2 主要方法

三、结果

四、讨论

第二章 HEV IgA捕获法ELISA的建立及评价

一、前言

二、材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 HEV IgA捕获法ELISA的应用

三、结果

四、讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢