载脂蛋白A5基因克隆表达及载脂蛋白A5与糖尿病血脂异常关系的研究

摘要

第一章重组人载脂蛋白A5原核表达载体的构建及分析鉴定 目的：构建重组人载脂蛋白A5（apoA5）原核表达载体，诱导表达目的蛋白，为进一步制备抗apoA5的单/多克隆抗体奠定基础。 方法：从人肝癌组织中抽提总RNA，以此为模板，逆转录降度PCR扩增载脂蛋白A5编码区基因全长，构建含有目的片断的克隆载体pPCR-Script ampSK（+）-apoA5及原核表达载体pET16B-apoA5，并通过酶切、测序及诱导表达等验证重组质粒的准确性，SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达量，Ni-NTA柱亲和纯化重组蛋白，梯度透析复性目的蛋白。 结果：成功构建apoA5的克隆载体pPCR-Script ampSK（+）-apoA5和原核表达载体pET16B-apoA5，用第一对引物扩增重组质粒，片段大小与PCR产物结果相符。由测序结果得知，人apoA5编码区cDNA片段按设计完整、准确地装入pET16B中，保证了目的蛋白表达的正确性。1mmol/L异丙基硫基-b-D-半乳糖苷（IPTG）、31℃诱导4h，经SDS-PAGE电泳可见43KDa处有目的条带。计算机处理，表达蛋白占菌体总蛋白的30％，纯化复性后，目的蛋白浓度可达3μg/μl。 结论：成功构建了重组人载脂蛋白A5原核表达载体，大肠杆菌成功表达重组蛋白apoA5。 第二章载脂蛋白A5多克隆抗体的制备与临床应用 目的：制备高效特异的载脂蛋白A5（apoA5）多克隆抗体，利用该抗体检测高血脂患者血清apoA5活性水平，建立定量检测血清apoA5 ELISA法。 方法：将纯化后的His-apoA5融合蛋白，免疫新西兰大白兔，制备抗apoA5多抗。经酶联免疫吸附分析技术（ELISA）、Western印记、Dot-blot等方法进行鉴定。同时收集不同TG浓度血清标本初步用于临床分析检测。 结果： 1．ELISA方法测定多抗效价，所得抗体效价为1：104，可用于对抗原进行检测。中和抑制实验表明，随着apoA5抗原浓度的增加，PVDF膜上的蛋白条带颜色渐弱，与所加入的中和抗原的浓度成反比，说明抑制有效，提示该抗体是特异性的针对apoA5抗原。 2．以制备的抗apoA5兔血清作一抗，进行Western印记检测，结果显示，纯化的重组蛋白、正常血脂者血清及正常血脂者肝脏裂解液均出现了特异反应条带，而在脾、肾、肠的混合裂解液中未见有反应条带，表明所制备的抗体与apoA5特异结合。 2．Dot-blot结果表明自制的apoA5多抗可以检测重组蛋白和血清中天然的apoA5蛋白，与无关蛋白不反应。加入待测血清越多，斑点面积越大越深。纯化的重组apoA5蛋白和正常血脂者血清的斑点图均比高TG者血清的斑点图浓，进一步说明apoA5与TG的负相关关系。 结论：本研究利用新西兰大白兔制备了抗apoA5多克隆抗体，Western印记和Dot印记均表明自制的多抗特异性高，可以检测重组蛋白和血清中天然的apoA5蛋白，为高甘油三酯血症和冠心病的预防、诊断、治疗及致病机理的研究提供新的思路和理论依据。 第三章糖尿病患者血清载脂蛋白A5检测的临床应用 目的：检测糖尿病患者血清载脂蛋白A5（apoA5）水平，探讨apoA5与血脂及糖尿病的相关性。 方法：收集Ⅱ型糖尿病233例，健康体检者200例，留取血清标本用于血糖（GLU）、胆固醇（CH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、脂蛋白a（Lp（a））、载脂蛋白AⅠ（apoAⅠ）、载脂蛋白B（apoB）的检测，血清apoA5水平的检测采用本实验室建立的双抗体夹心ELISA法，检测抗体为本实验室制备。 结果： 1．apoA5、Lp（a）与糖尿病的关系糖尿病组女性血清Glu、TG、Lp（a）及apoA5高于男性，均明显高于对照组，差别有统计学意义。 2．应用百分位数法（P2．5～P97．5）计算apoA5参考范围为255．92～563．51μg/L。 3．糖尿病组与对照组比较，血清Tch、TG、LDL-c及ApoB明显增高，而HDL-C、apoAⅠ及apoAⅠ/apoB低于对照组，组间差别有统计学意义。 4．apoA5与血脂各指标相关性在本研究病例组中，血清apoA5水平与Glu、Lp（a）呈负相关，相关系数分别为：-0．40、-0．24，差异有显著性，血清apoA5与TG、TC仅存在负相关的趋势（r=-0．14，r=-0．07），但是没有达到统计学差异，其中女性，血清apoA5水平与TG呈负相关（r=-0．41），男性和糖尿病总体中仅存在负相关趋势；apoA5浓度在总人群与HDL-C呈正相关，相关系数为：0．36。 结论：女性血清apoA5与TG呈负相关，且显著影响患者血清TG代谢水平，提示apoA5水平降低可能是糖尿病的危险因素，推测适时监测血清apoA5水平对糖尿病的早期干预有积极的意义。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

综述一：单克隆抗体技术的研究进展及其在心血管疾病中的应用

综述二：载脂蛋白A5的研究现状

第一章 重组人载脂蛋白A5原核表达载体的构建及分析鉴定

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二章 载脂蛋白A5多克隆抗体的制备及临床应用

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三章 2型糖尿病患者血清载脂蛋白A5检测的临床应用

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

致谢

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