检测DNA甲基化新型微阵列芯片研究

摘要

DNA甲基化是～种重要的表观遗传学修饰，在过去的10年，DNA甲基化研究领域快速发展并成为分子遗传学的一个重要分支。DNA甲基化参与基因的转录调控，X染色体失活，发育调控和细胞分化。异常的DNA甲基化与癌症及许多其他疾病的发生密切相关。然而，目前对于DNA甲基化在人类基因组中的认识十分有限。一定程度上说缺少高通量的研究技术是阻碍基因组水平研究DNA甲基化功能的关键原因。基因芯片由于其极高的检测通量，在基因组学、药物学、医学检验等领域中得到了越来越广泛的关注。本论文DNA甲基化为研究对象，从探针设计、DNA模板制备、甲基化特异识别分子和检测方式等多种角度，提出一系列创新性思路与方法，设计新型的检测DNA甲基化微阵列芯片，并利用这些芯片检测技术，开展了对肿瘤细胞系和癌症样本的甲基化研究，这些技术包括：用于测定多个特定CpG位点的单碱基单荧光延伸检测DNA甲基化技术和单碱基双荧光检测DNA甲基化技术，用于测定CpG岛密度的基于通用靶标序列微阵列的CpG岛高甲基化测定技术、基于滚环扩增检测CpG岛高甲基化检测技术、利用甲基化结合蛋白测定DNA甲基化密度的方法以及不只是限于甲基化测定的基于硫代保护的DNA测序技术。具体内容如下：
　　 1.单碱基单荧光延伸检测DNA甲基化技术
　　 我们以p16和E-cad基因启动子区的CpG岛为研究对象，针对要检测的CpG位点，设计一对5′末端为氨基，3′末端碱基为C或T，特异识别亚硫酸氢盐反转后甲基化与非甲基化变化的探针，探针对的数量与要研究的目的片段中CpG位点数量一致，并将这些探针对点样于醛基片上构建微阵列。将10例乳腺癌细胞系和2例正常人外周血细胞DNA用亚硫酸氢盐处理，经过PCR扩增后，得到双链DNA片段，其中非甲基化胞嘧啶转变为胸腺嘧啶(T)，甲基化胞嘧啶经过扩增后转变为非甲基化胞嘧啶(C)，再将PCR产物用外切酶处理成为单链，将单链化模板与探针对微阵列进行杂交并在片延伸带有荧光标记的dGTP，由延伸信号的强弱可以清楚准确的识别模板中的甲基化状态。
　　 为了能够同时得到样本中特定CpG位点甲基化与非甲基化的信息，我们使用两种不同的荧光标记物(Cy3-dUTP和Cy5-dCTP)并设计了一种新颖的探针分子，其结构包含两个部分：靠近5′端部分为唯一性序列标签，靠近3′端部分为位点特异性序列，该位点特异性序列识别的是紧挨着某一特定CpG位点的3′端序列，并将可能覆盖到的其他CpG位点做简并处理。将氨基标记的与唯一性序列标签互补的靶标点样于醛基片上构建微阵列。我们以p16和E-cad基因启动子区的CpG岛为研究对象，将5例乳腺癌细胞系DNA和8例未经放疗或化疗的乳腺癌及相应癌旁组织样本DNA进行亚硫酸氢盐反转，保留甲基化信息；PCR扩增出目的片段与带有唯一性序列标签的位点特异性探针杂交，延伸单个带有荧光标记的碱基(Cy3-dUTP或Cy5-dCTP)，最后与靶标微阵列杂交，Cy3信号强度代表CpG位点的非甲基化程度，Cy5则代表同一位点的甲基化程度。
　　 3.基于通用靶标序列微阵列的CpG岛高甲基化测定技术
　　 除了特定CpG位点的甲基化信息，不同基因CpG岛的整体甲基化状态更利于临床性研究与诊断。本技术所使用的带有唯一性序列标签的序列特异性探针其序列特异性部分识别的不再是某个特定的CpG位点，而是特定的CpG岛片段，与唯一性序列标签对应的靶标，其规模可以根据研究需要加以扩大或减少，由于标签和靶标与研究对象、研究目的没有相关性，使得该技术更具通用性。该技术一种分析CpG岛高甲基化状态的半定量技术，我们以16个基因的64个CpG岛为测定对象，将33例样本的基因组DNA经过MseⅠ酶切，割胶获取适当的区域，将纯化后的酶切片段连接上公共的连接子，连接后的片段用甲基化敏感性酶HpaⅡ和HhaⅠ保留高甲基化信息，然后进行Linker-PCR，扩增产物与带有唯一性序列标签的序列特异性探针杂交并延伸出荧光信号；延伸产物与通用靶标微阵列杂交进行信号扫描，并与标准曲线比较，判断甲基化程度的高低。
　　 4.基于滚环扩增检测CpG岛高甲基化检测技术
　　 除了从设计新型探针角度出发构建DNA甲基化测定芯片之外，我们还研究了利用滚环扩增制备用于甲基化测定的全基因组模板的可行性。进行滚环扩增的前提是制备环状的模板，我们设计了一种发卡结构的连接子，成功的制备出了哑铃状环状DNA模板。我们以p16基因启动子区CpG岛片段为检测对象，分析了12例肝癌细胞系基因组DNA滚环扩增结果。基因组模板先用Tsp509I酶进行酶切，保留了大部分CpG岛的完整；酶切片段与发卡结构的连接子连接，形成哑铃状环状分子；用甲基化敏感酶Hpa Ⅱ保留高甲基化片段，用两种外切酶，Lambda外切酶和Exonuclease Ⅰ，去除非环状分子，加入Phi29DNA聚合酶进行滚环扩增，扩增产物固定在尼龙膜上，与地高辛标记的探针进行杂交，最后用化学发光检测技术成功获得甲基化信息。
　　 5.利用甲基化结合蛋白测定DNA甲基化密度的方法
　　 通常用于甲基化检测的标记分子是核苷酸单体，其上标记着放射性同位素、荧光、生物素等；此外还有识别甲基化胞嘧啶的抗体以及甲基供体。本方法将甲基化结合蛋白(HMBD)与荧光分子相偶联，利用这种标记分子构建了一种检测DNA甲基化密度的微阵列芯片。甲基化结合蛋白能购识别甲基化的CpG二联体，为了区分目标序列中CpG位点的甲基化和非甲基化状态，我们首先将7例肝癌细胞系和2例正常人外周血样本基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，利用PCR扩增，获得6种不同CpG岛片段产物，将扩增后的带氨基标记的PCR产物固定在醛基片上，构建微阵列芯片，用甲基化转移酶SssⅠ将芯片上PCR产物中的所有CpG位点甲基化，用末端转移酶TdT将TAMRA-dUTP转移到固定在基片上的PCR产物末端，用TAMRA的量表示固定PCR产物的量，将基片与Cy5-HMBD蛋白孵育，Cy5荧光强度表示甲基化位点的数量；根据标准曲线，Cy5/TAMRA的比值表示目标区域中甲基化CpG的密度。
　　 6.基于硫代保护的DNA测序技术
　　 DNA测序技术具有广阔的应用前景，其应用范围不仅限于甲基化研究，国内目前尚未发展出可以与Solexa和Solid技术相媲美的测序方法。我们希望发展出拥有自主知识产权的测序技术，由此我们提出了基于硫代保护的DNA测序技术原型，并对其进行了可行性研究，该技术主要利用外切酶Ⅲ对双链DNA具有特异性的3′→5′外切活性，而硫代核苷键对外切酶Ⅲ的外切活性具有拮抗作用的特性。我们以T7噬菌体基因组DNA为模板，将其超声破碎后进行环化，环化基因组片段模板在乳液液滴中得以单克隆扩增，将扩增产物固定在固相基底上，变性去除互补链之后，杂交上硫代修饰的测序引物；用含有单一已知核苷酸单体混合物（荧光标记的与正常的核苷酸单体）的延伸反应溶液进行延伸反应，此时，形成的是正常的核苷键；延伸上的荧光碱基通过外切酶Ⅲ的3′-→5′外切活性去除；然后延伸具有与已知核苷酸相同类型的硫代核苷酸单体，使之形成硫代核苷键，拮抗下一次的酶切反应，确保引物进一步向前延伸，用含第二种己知核苷酸单体的延伸反应溶液进行延伸反应，重复之前的步骤。根据碱基互补配对原则，只有加入的核苷酸单体与紧接着延伸的模板上的碱基相互配对，延伸反应才能进行，因此，四种碱基(A、T、C、G)依次轮流加入，最终获得模板序列的碱基信息。