稳定表达pAcGFP1-Actin蛋白PC12细胞系的建立及在细胞骨架研究中的应用

摘要

PC12细胞系克隆于大鼠嗜铬细胞瘤，它在神经生长因子（NGF）的诱导下，能够向神经元细胞方向分化，并具有神经元细胞的很多生理特征，因此PC12细胞作为一种模型细胞被广泛使用。本论文目的是建立能够稳定表达GFP-Actin融合蛋白的PC12细胞系，并在此基础上初步探究外界物理刺激和脂质体对细胞骨架的影响。Actin蛋白作为细胞骨架的基本组成单位，在细胞骨架的建立、重构以及细胞迁移等正常生理活动中有重要作用，对Actin蛋白进行荧光标记就可以对PC12细胞骨架进行实时观察，而绿色荧光蛋白（GFP）能够在很多不同的细胞中稳定表达，其发出的荧光稳定，不易淬灭，在细胞中表达对细胞没有毒性，被广泛的用于细胞内荧光观察。因此，建立能够稳定表达GFP-Actin融合蛋白的细胞系就能够实现对PC12细胞骨架的实时观察。
　　 本研究使用脂质体转染技术将含有pAcGFP1-Actin基因序列的真核表达质粒载体导入PC12细胞内，同时使用阳离子聚合物为载体介导转染，以比较两种介导材料的效率高低。通过G418筛选，建立稳定表达pAcGFP1-Actin融合蛋白的PC12细胞系。在这个基础上，初步探究生物相容性材料脂质体对PC12细胞的微丝性骨架的影响以及AFM针尖对PC12细胞骨架局部刺激后细胞骨架的变化。本论文的主要研究工作分为三部分：
　　 首先，利用脂质体和阳离子聚合物介导的基因转染技术将含有pAcGFP1-Actin基因序列的真核表达质粒导入正常的PC12细胞，并比较两种载体的转染效率。使用G418筛选，建立稳定表达pAcGFP1-Actin蛋白的PC12细胞系。
　　 其次，用乙醇注入法制备脂质体，用不同浓度的脂质体溶液与PCl2细胞共培养，观察细胞在脂质体存在的条件下细胞骨架的变化，从而评估脂质体对PC12细胞骨架的影响。
　　 最后，利用原子力显微镜的针尖对PC12细胞表面进行局部物理刺激，用荧光倒置显微镜实时观察细胞骨架的修复情况。
　　 使用阳离子聚合物和脂质体介导的转染方法，都成功的构建了稳定表达pAcGFP1-Actin蛋白的PC12细胞系。在本实验室条件下，阳离子聚合物的转染效率要略高于脂质体的转染效率。用乙醇注入法制备的脂质体对PC12细胞存在一定的毒性，在较高浓度脂质体存在的条件下，12小时后，细胞骨架趋向于解聚，细胞形态显现典型的毒性反应。但是低浓度的脂质体对细胞骨架的影响并不明显。使用AFM针尖对PC12细胞表面局部进行物理刺激后，细胞骨架有微小创伤，局部荧光消失。在刺激后35分钟内，细胞骨架荧光恢复。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 研究背景:

1.1.1 基因转染技术

1.1.2 绿色荧光蛋白(GFP)

1.1.3 肌动蛋白(actin)与细胞骨架(cytoskeleton)

1.1.4 大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞(PC12)

1.2 研究目的:

1.3 研究内容:

1.4 小结:

第二章 pAcGFP1-actin质粒转染PC12细胞以及稳定细胞系的建立

2.1 材料与方法

2.1.1 实验仪器:

2.1.2 质粒:

2.1.3 关键试剂:

2.1.4 细胞培养:

2.1.5 G418对于PC12细胞的筛选浓度的确定

2.1.6 阳离子聚合物介导的细胞转染

2.1.7 脂质体介导的细胞转染

2.1.8 细胞转染效率的统计

2.1.9 细胞筛选

2.2 实验结果与讨论

2.2.1 G418对PC12细胞筛选浓度的确定

2.2.2 两种转染方法对比及最佳转染条件的确定

2.3 小结

第三章 脂质体的制备及其对PC12细胞微丝性骨架的影响

3.1 材料与方法

3.1.1 实验仪器

3.1.2 关键试剂

3.1.3 使用乙醇注入法制备大单室脂质体

3.1.4 基于粒径的脂质体的进一步分离

3.1.5 脂质体与PC12细胞共培养

3.2 实验结果与讨论

3.3 小结

第四章 PC12细胞在受到AFM针尖局部物理刺激后的细胞骨架变化实时观察

4.1 材料与方法

4.1.1 实验仪器

4.1.2 关键试剂

4.1.3 PC12细胞的正常培养及盖玻片爬片培养

4.1.4 原子力显微镜(AFM)针尖扫描细胞胞体并对其进行物理损伤

4.1.5 PC12细胞的细胞骨架的实时观察

4.2 实验结果与讨论

4.2.1 在AFM平台上对PC12细胞的实时观察

4.2.2 使用AFM针尖对PC12细胞局部进行物理刺激

4.2.3 PC12细胞在受到AFM针尖局部物理刺激后的细胞骨架变化实时观察

4.3 小结

第五章 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

致谢

附录:攻读硕士学位期间发表的学术论文