葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂联合汉防己甲素逆转K562/A02细胞耐药性的研究

摘要

目的：本课题旨在研究联合应用葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂D，L-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol（PDMP）和汉防己甲素（tetrandrine，Tet）逆转K562/A02细胞柔红霉素（daunorubicin，DNR）耐药，并测定葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase，GCS）和多药耐药基因1（multidrug resistance genel，mdrl）的转录与表达情况，以探讨药物逆转多药耐药（multidrug resistance，MDR）的可能机制，为临床白血病的治疗提供一定的理论依据。
　　 方法：（1）采用甲基四唑蓝法（MTT）检测PDMP、DNR、PDMP+DNR、Tet+DNR、DNR+PDMP+Tet分别作用于K562/A02细胞和K562细胞48小时后对细胞增殖的影响，计算出其半数抑制量（the half maximal inhibitory concentration，IC50）和逆转倍数（foldreversal，FR）；（2）采用流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测PDMP、Tet、PDMP+Tet分别与0.51μg/ml DNR联用对K562/A02细胞的凋亡和细胞内DNR浓度的影响；（3）采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）测定PDMP、Tet及两药联合作用于细胞48小时后，mdrl mRNA、GCS mRNA表达变化。（4）采用Western blot测定PDMP、Tet及两药联合作用于细胞48小时后，P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、GCS水平变化。
　　 结果：（1）PDMP≤20μmol/l对K562及K562/A02细胞株无明显生长抑制作用（细胞增殖抑制率<10％），选择20μmol/l PDMP作为逆转剂浓度；（2）20μmol/l PDMP或1μmol/lTet能增加K562/A02细胞对DNR的敏感性，两种逆转剂联用时效果更明显。DNR对K562和K562/A02细胞的IC50分别为（0.234±0.02）μg/ml和（7.064±0.53）μg/ml，差异有统计学意义（p<0.05）；DNR分别联合PDMP或Tet，以及三药联合作用K562/A02细胞48小时后，对K562/A02的IC50分别为（2.924±0.24）μg/ml、（1.53±0.17）μg/ml和（0.69±0.03）μg/ml，FR分别为2.42、4.61和10.23倍；但PDMP或Tet联合DNR以及三药联用对K562细胞增殖的影响与未加逆转剂组相比，差异无统计学意义（p>0.05）（IC50分别为（0.25±0.02），（0.22±0.01）和（0.21±0.01）μg/ml）。（3）FCM检测显示①对照组K562/A02细胞48小时凋亡率为（2.11±0.35）％；0.5μg/ml DNR单独作用于K562/A02细胞凋亡率为（5.43±0.70）％；DNR分别联合20μmol/l PDMP和1μmol/l Tet，以及三药联合时，K562/A02细胞凋亡率分别为（18.06±1.46）％、（21.93±1.98）％和（42.77±2.32）％；②0.5μg/ml DNR单独作用于K562/A02细胞48小时后，细胞内DNR平均荧光强度为1554.67±91.09，DNR分别联合20μmol/l PDMP、1μmol/l Tet及三药联合处理K562/A02细胞后，细胞内DNR平均荧光强度分别为1975.33±111.54、2069.67±118.29和4435.33±151.13，不同处理组细胞内DNR浓度的差异有统计学意义（p<0.05）。（3）RT-PCR和Western blot检测显示①K562细胞mdrl和GCS基因在mRNA和蛋白水平呈低表达，两种基因均在K562/A02细胞呈高表达；20μmol/l PDMP能下调K562/A02细胞内GCS基因的表达，Tet能下调K562/A02细胞内mdrl基因的表达，联合用药对两种基因的表达下调效果更明显（p<0.05）；②PDMP能抑制mdrl基因的表达而Tet也能下调GCSmRNA和蛋白含量。
　　 结论：（1）20μmol/l及以下浓度的PDMP对K562及K562/A02细胞株无明显细胞毒性；（2）PDMP和Tet均能提高K562/A02细胞对DNR的敏感性，增加细胞凋亡率和细胞内药物浓度，当两药联合时效果更明显；（3）PDMP能下调K562/A02细胞内GCS基因的表达，Tet能下调mdrl基因的表达，联合用药对两种基因的表达下调效果更明显；（4）PDMP能下调mdrl mRNA和蛋白水平而Tet也能下调GCS基因的表达。

目录

文摘

英文文摘

中英文对照及部分缩略词

前 言

文献综述

第一部分 材料与方法

第二部分 实验结果

第三部分 讨 论

致 谢

全文小结

参考文献

作者简介