新靶点药物治疗大肠癌的实验研究

摘要

目的：
　　 大肠癌是全球高发常见的恶性肿瘤，对现有治疗药物反应差。本世纪以来，新靶点药物治疗大肠癌已成为继手术、放疗、化疗之后的第四治疗模式。本研究拟明确新靶点药物中药砒霜制剂三氧化二砷（As2O3）注射液和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）西达本胺对体内外人大肠癌细胞生长的作用及其作用机制，为临床应用提供实验依据。
　　 方法：
　　 1.应用不同浓度As2O3注射液或As2O3注射液联合氟尿嘧啶（5-Fu）体外作用于人类大肠癌细胞株LoVo和CoLo-3200～72h，采用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法、吖啶橙/溴乙锭（AO/EB）荧光染色法、透射电镜技术、DNA电泳、流式细胞术、免疫细胞化学法、Western蛋白印迹分析和银染-TRAP法等方法，观察上述药物对人类大肠癌细胞株生长的影响、联合用药性质及其作用机制。在体内研究中，建立人结肠癌裸鼠的移植瘤模型，在成瘤鼠腹腔内分别连续注射生理盐水、5-Fu、As2O3注射液和As2O3注射液+5-Fu，14d后比较各组裸鼠抑瘤作用，并对体内移植瘤标本分别行光学显微镜和透射电镜观察、原位末端标记（TUNEL）、免疫组织化学法、银染-TRAP法和RT-PCR检测。同时应用两药相互作用系数（CDI）评价联合用药在体内外的相互作用性质。
　　 2.应用不同浓度西达本胺干预人大肠癌细胞株LoVo和HT-290～72h，采用MTT法检测其对细胞增殖的影响，流式细胞技术检测细胞凋亡率和细胞周期改变，透射电镜观察细胞超微结构变化，Western蛋白印迹法分析细胞组蛋白乙酰化水平、细胞信号通路蛋白、细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的表达情况。
　　 结果：
　　 1.体外实验中，As2O3注射液能显著地抑制人大肠癌细胞LoVo和CoLo-320的生长，并呈量效和时效特点；用药后出现了典型的细胞凋亡的形态学和生化学改变，表现为细胞皱缩，胞浆浓缩，可见胞浆起泡及凋亡小体形成，细胞核固缩，核内染色质聚集于核膜内侧呈团块或新月状，细胞表面微绒毛减少，甚至消失，细胞DNA在琼脂糖凝胶电泳呈现显著的凋亡特征条带。流式细胞术分析结果提示As2O3注射液能有效地诱导两株人大肠癌细胞凋亡，同时As2O3注射液将两株人大肠癌细胞周期阻滞于S期，并使癌细胞Bcl-2基因表达明显下降，Bax和Fas基因表达显著增强，且显著抑制癌细胞端粒酶活性。与As2O3注射液或5-Fu单药作用相比，As2O3注射液与5-Fu联合应用可显著增强抑制人大肠癌细胞增殖，并使诱导癌细胞凋亡作用增强，S期细胞比例下降，G0/G1期细胞比例上升，癌细胞Bcl-2基因表达明显下降，Bax和Fas基因表达显著增强，且显著增强抑制癌细胞端粒酶活性（p值均<0.05）。体内实验中，As2O3注射液能够明显抑制结肠癌裸鼠移植瘤的增长，用药后诱导移植瘤细胞出现了典型的细胞凋亡的形态学和生化学改变，表现为细胞出现核固缩、碎裂，细胞皱缩，胞浆电子密度增高，可见胞浆起泡及凋亡小体形成，线粒体肿胀、空泡化，胞膜完整。TUNEL法检测可见核呈棕色着染的凋亡细胞呈片状分布，细胞核固缩或碎裂，大小不一。免疫组化法观察联合用药组瘤组织中Bcl-2蛋白阳性细胞数减少，Bax和Fas蛋白阳性细胞数增多，且明显抑制瘤细胞端粒酶活性及其催化亚单位表达。与As2O3注射液或5-Fu单药作用相比，As2O3注射液联合5-Fu可显著增强抑制裸鼠人结肠癌移植瘤增长，CDI值<1。光学显微镜下可见联合用药组瘤体组织标本大部分组织细胞发生细胞凋亡改变，TLINEL法检测见As2O3联合5-Fu可显著增强诱导大肠癌细胞凋亡作用，免疫组化法观察联合用药组较各单药组瘤组织中Bcl-2蛋白阳性细胞数减少，Bax和Fas蛋白阳性细胞数增多。与生理盐水组相比，As2O3注射液联合5-Fu可显著抑制瘤细胞端粒酶活性及其催化亚单位端粒酶逆转录酶基因蛋白表达。
　　 2.西达本胺在体外可以呈时间-剂量依赖性地抑制LoVo和HT-29细胞生长，并能有效诱导细胞凋亡。西达本胺作用于两株细胞后，均观察到细胞凋亡的超微结构变化；流式细胞术分析结果提示，西达本胺能有效地诱导两株人大肠癌细胞凋亡；Western-blot检测结果显示，西达本胺作用两株细胞后，cleaved Caspase-3的表达量均随药物作用浓度增加而上调，同时PRAP被剪切成片断，酶解片断的表达量随药物作用浓度增加而上调。西达本胺能增强两株细胞内组蛋白H3的乙酰化水平，上调细胞周期调控因子p21和下调CDK4蛋白的表达水平，而阻滞细胞于G0/G1期。同时，西达本胺对细胞生长相关信号转导通路P13K/Akt和MAPK/Ras均有明显抑制作用。
　　 结论：
　　 1.As2O3注射液在体、内外均具有良好的抗大肠癌作用，此作用具有量效和时效特点，作用机制与As2O3抑制癌细胞端粒酶活性、阻滞细胞周期于S期、下调抗凋亡基因Bcl-2表达和上调促凋亡基因Bax和Fas表达所引起的癌细胞凋亡有关。
　　 2.As2O3注射液联合5-Fu在体、内外均可显著提高抗大肠癌作用，其相互作用具有协同作用，其机制可能是增强诱导癌细胞凋亡、增强下调抑凋亡基因Bcl-2及上调促凋亡基因Bax和Fas的表达、抑制癌细胞端粒酶活性及其催化亚单位表达、增强细胞周期调控剂与细胞周期特异性药物联合作用。
　　 3.西达本胺在体外呈时间-剂量依赖性抑制人大肠癌细胞生长，并有效诱导大肠癌细胞凋亡，西达本胺能增强大肠癌细胞内组蛋白H3的乙酰化水平，阻滞细胞于G0/G1期并阻断相关细胞生长信号转导通路P13K/Akt和MAPK/Ras表达。该药有可能成为一种有效的治疗大肠癌的HDACi，值得今后进一步行深入研究。

目录

文摘

英文文摘

主要缩略词表

前言

综述一

参考文献

综述二

参考文献

第一部分 三氧化二砷治疗大肠癌的实验研究

第一章 三氧化二砷抗大肠癌作用的体外实验研究

1 材料与方法

2 结果

第二章 三氧化二砷抗大肠癌作用的体内实验研究

1 材料与方法

2 结果

第三章 三氧化二砷联合氟尿嘧啶抗大肠癌作用的体外实验研究

1 材料与方法

2 结果

第四章 三氧化二砷联合氟尿嘧啶抗大肠癌作用的体内实验研究

1 材料与方法

2 结果

小结

讨论

参考文献

第二部分 表观遗传修饰剂西达本胺诱导人大肠癌细胞凋亡并阻断相关信号传导通路的研究

1 材料与方法

2 结果

小结

讨论

参考文献

总结与展望

附录:

作者简介

致谢