基于基因表达谱芯片技术的天然羟基磷灰石成骨诱导机理研究

摘要

羟基磷灰石（HA）是临床常用的骨缺损修复材料之一，被认为具有良好的生物相容性和较好的成骨诱导性能。作为哺乳动物骨骼和牙齿的主要无机成分，羟基磷灰石在自然界中广泛存在。国内外的学者以猪骨、牛骨、珊瑚等为原料制备天然羟基磷灰石，并采用不同的实验方法分别从整体水平、细胞水平和分子水平等证实了天然HA具有较好的成骨诱导性能。然而，对羟基磷灰石，尤其是天然羟基磷灰石，成骨诱导机理的研究都较少。从基因表达的水平深入理解HA的成骨诱导机理不仅可以更好地理解HA的生物学性能，对于骨修复材料的开发和应用也具有十分重要的意义。
　　 本论文的研究目的是在天然羟基磷灰石与小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）相互作用的细胞实验基础上，采用基因表达谱芯片技术和生物信息学分析相结合的方法，从分子水平分析研究天然羟基磷灰石的成骨诱导机理。
　　 本论文的具体工作如下：
　　 1.采用高温煅烧法从猪骨中提取了天然羟基磷灰石，并用粉末压片和高温烧结的方法将其压制成直径为2cm和10cm的圆盘状样品。通过红外光谱表征，证明煅烧提取和压片后的样品成分仅为羟基磷灰石；扫描电镜观察显示，天然HA样品表面疏松有孔。
　　 2.建立小鼠骨髓间充质干细胞原代和传代培养的方法，并采用MTT法测定其细胞活力代谢标准曲线。将MTT实验和流式细胞术应用于天然HA与小鼠MSCs相互作用检测，考察了材料表面生长不同时间（24h、48h和72h）的小鼠MSCs细胞增殖情况以及材料对细胞周期的影响。实验结果表明，天然HA对小鼠MSCs分化的促进导致了增殖率的下降，而对其细胞周期无明显影响。
　　 3.通过基因表达谱芯片技术获得与天然HA作用24h、48h和72h的小鼠MSCs基因表达谱，筛选得到3个时间点发生过差异表达的基因共8992个。根据基因的功能和差异表达情况，选择8个与MSCs成骨分化密切相关的基因进行荧光定量RT-PCR实验，验证了基因芯片实验结果，同时也进一步证实天然HA对小鼠MSCs成骨分化相关基因的影响。
　　 4.应用Cluster&TreeView软件、DAVID在线程序和GoSurfer软件对全部8992个差异表达基因分别进行层次聚类和GO功能分类分析。聚类结果显示，与材料作用48h和72h的实验组基因差异表达情况相似性较高。聚类分析将全部差异表达基因分成4个特征明显的聚类簇，GO分析表明各簇基因在功能上也表现出显著的差异，说明不同功能的基因在不同的时间点发生差异表达。从生物学过程、分子功能、细胞组分三个方面对8992个差异表达基因的GO功能分类分析发现，差异表达基因集中分布在某几个功能节点，如第二层次的细胞过程和生物过程的调控；结合和催化活性；细胞和细胞器等。
　　 5.根据基因的GO功能分类，在8992个差异表达基因中筛选得到了90个与成骨分化相关的差异表达基因。通过文献查阅与比较，发现筛选出的基因中不仅包含MSCs成骨分化过程中的标志性基因，还有一些在生物材料与骨细胞相互作用中发生差异表达的基因，除此之外，本论文也得到了一些在生物材料与MSCs相互作用中首次发现差异表达的基因，如Kruppel样因子10（K1f10）、齿状蛋白1（Jagl）等。分别采用Cluster&TreeView软件、DAVID在线程序、GoSurfer软件、GenMAPP软件包和IPA分析平台对这90个与成骨分化相关的差异表达基因进行了全面的生物信息学分析。层次聚类和GO功能分类分析结果表明，上调表达基因占优势，且基因与骨矿化、骨重建、成骨、成骨细胞分化等功能关系密切；分子功能主要涉及酶活性的调节，参与基因的表达调控；大多数基因作用的区域在细胞外基质。生物学途径和基因相互作用网络分析表明，天然HA可以通过影响TGF-β信号通路的关键基因来激活TGF-β信号通路，诱导小鼠MSCs的成骨分化。Notch、MAPK、Wnt等细胞生长、增殖、分化过程中十分重要的信号通路也可能受天然HA影响，参与MSCs成骨分化调控。基因之间存在错综复杂的相互作用，共同对这些信号通路进行调控，最终促进MSCs的成骨分化。综合以上分析结果，对天然HA成骨诱导机理进行了初步的解释。