基于基因表达谱芯片技术的金纳米粒子分子生物相容性机理研究

摘要

纳米生物材料具有许多优良的理化特性，在生物医学领域的应用日益广泛，为了使纳米生物材料在生物系统中的应用更加安全有效，建立纳米材料安全性评价的标准体系，研究纳米材料与细胞作用的机制越来越得到各界的重视。金纳米粒子作为一种纳米生物材料，在疾病诊断、药物载体、肿瘤治疗等许多生物医学领域有着广泛的应用。目前，关于金纳米粒子的分子生物相容性的研究还很少。本论文的研究目的是在金纳米粒子与细胞相互作用的检测基础上，采用基因表达谱芯片技术结合生物信息学分析，对金纳米粒子与人皮肤成纤维细胞（HumanDermalFibroblasts-fetal，HDF-f）的分子生物相容性机理进行研究。通过探索研究纳米材料与机体相互作用的机理的新途径，为建立基于基因表达谱芯片技术的纳米材料分子生物相容性评价的新方法打下基础。本论文的具体工作如下：
　　 1）采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备20nm纳米金溶胶并进行表征。考察200μM，20nm纳米金与HDF-f细胞作用1h、4h和8h后的情况。应用流式细胞术研究了纳米金对细胞周期和凋亡的影响，结果表明纳米金有促进S期细胞增加而G2/M期细胞减少的趋势。
　　 2）应用Illumina基因组表达谱芯片获得200μM，20nm纳米金与HDF-f细胞作用1h、4h和8h后差异基因表达情况，按照Illumina表达谱芯片筛选原则，1h、4h和8h这3个实验组中的差异表达基因分别为1212个，384个和492个，共计不重复具有GeneID的基因1794个。应用荧光定量RT-PCR实验对4个差异表达基因进行验证，验证基因的表达情况与基因表达谱实验一致。
　　 3）应用Cluster&TreeView软件对200μM，20nm纳米金作用HDF-f细胞1h、4h和8h后1794个基因进行聚类分析，按照差异表达基因的表达模式分为6簇。应用GoSurfer软件和DAVID数据库对6簇基因分别进行基因本体论（GeneOntology，GO）功能分类分析，发现具有类似表达模式的基因所涉及的基因在功能上有一定的相关性。应用GoSurfer软件对全部1794个差异表达基因按照生物学过程、分子功能、细胞组分结构层级进行GO功能分类研究。结果表明纳米金可能广泛影响细胞的生物学过程，细胞的核酸结合水平，转录因子的活性可能会有所改变，细胞内氧化还原状态和相应酶及受体活性、蛋白复合体和与DNA的复制有关的过程可能会受到影响。
　　 4）应用GenMAPP软件，对200μM，20nm纳米金作用HDF-f细胞1h、4h和8h后的全部差异表达基因参与的生物学途径进行分析，在GenMAPP数据库中找到的差异表达基因共有1740个，共得到包含差异表达基因的MAPPs90个，对其中25个MAPPs代表的生物学途径进行了详细讨论，包括17个在本课题小组前期基于蛋白质组学实验的金纳米粒子分子生物相容性机理研究结果中筛选出的途径，5个差异表达基因数目较多及所占途径总基因数的比例较高的途径以及3个与细胞周期有关的途径。将差异表达基因在生物学途径中所起到的作用与它们的表达模式和GO功能分类的分析结合起来，综合进行分析。
　　 5）应用IngenuityPathwayAnalysis（IPA）分析平台对200μM，20nm纳米金处理HDF-f细胞1h，4h和8h后发生差异表达的1794个基因进行分析，得到基因相互作用网络。对打分值最高的前5个网络进行具体分析。
　　 6）综合对差异表达基因的聚类、GO、生物学途径和基因相互作用网络分析，对纳米金与细胞相互作用的分子机理进行总结，纳米金与细胞作用的具体机制及其可能引起的主要生物学效应包括：纳米金可能会诱导细胞产生氧化应激，引起细胞内肌动蛋白骨架调控状态的改变，影响细胞的形态、粘附与迁移，纳米金可能对mRNA加工、细胞周期、能量代谢、受体信号传导等生物学过程产生影响。将本论文的研究结果与国内外纳米金生物相容性研究现状相比较，本论文除了得到了一些其他研究小组已经获得的纳米金与细胞相互作用关系可能的结论，还得到了一些其他研究小组未曾报道过的纳米金可能产生的其它生物学效应。将本论文的研究结果与本课题小组前期有关镍离子诱导的细胞毒性机理研究结论相比较，发现不同的生物材料与细胞作用后，虽然产生主要的细胞效应具有相似之处，但不同材料表现出不同的内在作用机理和基因调控方式，结合基因表达谱芯片和生物信息学分析方法，可以为研究细胞与材料作用的分子机理提供一种具有特异性和有效性的研究手段。与本课题小组前期基于蛋白质组学实验的金纳米粒子分子生物相容性机理研究中获得的差异表达蛋白质数据相比，尽管差异表达基因和蛋白在数量上有较大差异，但是差异表达基因和蛋白质所涉及的主要GO功能分类却是类似的，差异表达基因涉及的生物学途径包含差异表达蛋白涉及的全部生物学途径，细胞对于纳米金的响应在整个分子水平呈现出一定的相关性。将基因组学和蛋白质组学结合起来进行综合分析，两者的结果互为补充和印证，对于全面和深入的分析研究生物材料与细胞作用的分子机理具有很重要的意义。